钙蛋白酶与谷氨酸的兴奋性毒性

王 蕊 金 英 刘婉珠 隋海娟 (辽宁医学院药理学教研室，辽宁 锦州 2000)

谷氨酸是中枢神经系统的兴奋性神经递质，但其浓度过高将引起神经毒性。中风、颅脑损伤、癫痫〔1～3〕等急性脑病引起谷氨酸大量释放，导致神经毒性。此外，退行性神经疾病如阿尔茨海默病(AD)的发病机制也牵涉到兴奋性毒性〔4〕。高浓度谷氨酸引起NMDA受体过度激活，使Ca2+大量进入神经元，并进一步激活其下游钙蛋白酶。钙蛋白酶是半胱氨酸蛋白水解酶，有两种异构体，钙蛋白酶Ⅰ(μ-calpain)和钙蛋白酶Ⅱ(mcalpain)。两种钙蛋白酶激活所需的钙离子浓度不同，钙蛋白酶Ⅰ的激活需要微摩尔级的钙浓度，钙蛋白酶Ⅱ的激活需要毫摩尔级的钙浓度〔5〕。两种钙蛋白酶的作用底物相似，它们的过度激活与细胞损伤有着密切的关系〔6〕。本研究采用乳鼠大脑皮质神经元进行体外培养，观察钙蛋白酶Ⅰ在谷氨酸作用后的表达、细胞内定位及钙蛋白酶抑制剂MDL-28170对神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 谷氨酸，二甲基亚砜(DMSO)，DMEM，F12培养基，Hoechst 33258，胰蛋白酶(trypsin，1∶250)，L-多聚赖氨酸(poly-L-lysine)均购自Sigma公司。MTT试剂购于碧云天生物技术研究所。胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司。钙蛋白酶Ⅰ大亚单位多克隆抗体购于Cell Signal公司(Beverly，MA，USA)。MDL-28170，兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体，鼠抗神经丝蛋白(NF200)单克隆抗体，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗均购自Santa Cruz公司。β-肌动蛋白抗体和NBT/BCIP显色液购于Beyotime试剂公司。

1.2 细胞培养 取出生24 h以内的SD大鼠乳鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)。75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出大脑皮层，置于培养基中，剔除血管和软脑膜，剪成1 mm3左右的小块。加入0.125%胰蛋白酶，37℃消化10 min。待细胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM/F12培养基，终止消化。200目筛网过滤，离心10 min，用含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM/F12培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为(1～10)×108/L，接种在铺有L-多聚赖氨酸24孔或6孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。培养48 h后加入含阿糖胞苷(终浓度为5 mg/L)的培养基，抑制非神经细胞增殖。以后每3天换液1次，培养7 d后用于实验。应用抗NSE多克隆抗体和抗NF200抗体免疫荧光染色进行神经元纯度鉴定，结果表明神经元纯度在90%以上。

1.3 实验分组 细胞分为对照组;谷氨酸组：加入谷氨酸(100 μmol/L)作用 24 h;谷氨酸 +MDL-28170组：先加入MDL-28170(10 μmol/L)作 用 30 min，然 后 加 入 谷 氨 酸(100 μmol/L)作用 24 h;MDL-28170 组：加入 MDL-28170(10 μmol/L)作用24 h，MDL-28170 浓度根据文献报道〔7〕和预实验确定。

1.4 MTT法测定细胞活力 将接种在96孔培养板的神经元按以上分组处理后，加入MTT(终浓度0.5 g/L)培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，待颗粒溶解后，在570 nm的吸光值下检测各孔的吸光度值(A)，并根据公式计算细胞生存率。细胞生存率(%)=(A实验组-A空白组)/(A正常对照组-A空白组)×100%。

1.5 Hoechst33258核染色检测细胞凋亡情况 依据Jin等〔8〕的方法，按以上分组加入药物处理后，移去培养基，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，4%的多聚甲醛固定20 min，弃固定液，双蒸水冲洗2次，Hoechst33258 5 mg/L避光染色10 min，用双蒸水冲洗2次，室温晾干后于荧光显微镜(Olympus)下观察拍照。每组取4张盖玻片，每张片随机选取4个高倍视野，计算凋亡细胞占每个视野总细胞数的百分比，求出16个视野平均百分比，作为该样本的凋亡百分比。

1.6 免疫荧光染色检测钙蛋白酶Ⅰ表达 培养7 d的皮层神经元，经各因素处理后，移去培养基，用冷PBS洗2次，然后用4%的多聚甲醛固定30 min，弃固定液，PBS洗3次，每次10 min，然后用 TritonX-100 0.3%作用30 min，PBS洗3次，每次10 min，3%BSA封闭30 min，然后加入钙蛋白酶Ⅰ大亚基的多克隆抗体(1∶100)4℃过夜后，PBS洗3次，再加入罗丹明标记的二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3次，Hoechst33258核复染10 min，PBS洗3次，每次10 min，最后甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.7 Western蛋白印迹检测钙蛋白酶Ⅰ蛋白水平 原代培养的神经细胞，经各种因素处理后，用冷PBS冲洗，立即放入预冷的裂解缓冲液中4℃ 超声粉碎后，离心30 min，取上清，用Lowry等法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品，将各组蛋白浓度调成一致。用10% ～12%(SDS-PAGE分离蛋白质，每个泳道蛋白上样量为20 μg。为了准确判断目的蛋白带的位置，一个泳道加SeeBlue Plus 2预染蛋白标记物，电泳后将PAGE凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后将膜放入3%BSA阻断缓冲液中，封闭60 min，再用TBS，洗膜3次，每次10 min。将膜放入一抗中(抗体1∶500稀释)，4℃过夜。TTBS冲洗后，将膜放入二抗中，室温孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min，置硝基四氮唑蓝/5溴-4氮-3吲哚磷酸盐(NBT/BCIP)显色液中显色，直至出现，终止反应。每个抗体测定时都将与β-actin相应的膜用TBS洗3次后，将膜放入βactin抗体中，4℃过夜，进行杂交，TTBS冲洗后，将膜放入二抗中，室温孵育1 h。再用TTBS洗膜3次后，放入NBT/BC IP显色液中避光显色，直至显色，终止反应，以保证蛋白上样量的一致性。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成像软件Chem Image 5500对蛋白带进行积分吸光度值(IA)分析。

2 结果

2.1 MDL-28170抑制谷氨酸引起的神经元细胞活力降低 谷氨酸组神经元细胞活力较对照组明显降低〔(71.5±6.1)%vs(100.0±5.4)%，P＜0.01〕，谷氨酸+MDL-28170组较谷氨酸组明显升高〔(89.0±2.6)%，P＜0.01〕。MDL-28170单独使用对神经元细胞活力没有影响〔(97.5±1.9)%，P＞0.05〕。

2.2 MDL-28170抑制谷氨酸引起的神经元凋亡 图1可见，对照组神经元凋亡百分比为(8.7±1.3)%(n=16)，谷氨酸组为(35.4±6.9)%(n=16，与对照组比较 P＜0.01)，谷氨酸+MDL-28170组为(13.4±1.6)%(n=16，与谷氨酸组比较P＜0.01)，MDL-28170单独应用对细胞凋亡百分比没有影响(10.7±1.1)%。凋亡神经元的特征是胞核缩小，染色质浓缩，或核碎裂(图1，箭头)。

2.3 谷氨酸引起皮质神经元钙蛋白酶Ⅰ表达增加 钙蛋白酶Ⅰ免疫荧光染色结果显示，谷氨酸作用24 h后，钙蛋白酶Ⅰ表达较对照组明显增多，而且钙蛋白酶Ⅰ主要表达在凋亡的细胞核内(箭头所示)。Western蛋白印迹结果显示，与对照组相比谷氨酸组80 kD和76 kD钙蛋白酶Ⅰ蛋白水平明显增加。见图2、图 3。

图1 MDL-28170抑制谷氨酸引起的皮质神经元凋亡(×400)

图2 谷氨酸对皮质神经元钙蛋白酶Ⅰ蛋白水平的影响

图3 谷氨酸对钙蛋白酶Ⅰ(μ-calpain)表达的影响(×400)

3 讨论

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体是钙通道耦联受体。细胞外异常增多的谷氨酸过度激动NMDA受体使钙离子大量进入细胞内并激活钙蛋白酶。钙蛋白酶由大亚基(80 kD)和小亚基(30 kD)构成，激活时首先大小亚基分离，然后大亚基自溶产生76 kD活性产物〔9〕。本研究发现谷氨酸作用24 h后，钙蛋白酶80 kD大亚基与76 kD活性产物明显增多，而钙蛋白酶抑制剂MDL-28170明显抑制了谷氨酸引起的神经元损伤。钙蛋白酶被激活后通过水解细胞骨架蛋白，可引起细胞形态的改变;此外钙蛋白酶还可劈切抗凋亡蛋白Bcl-2，导致细胞色素c的释放而激活线粒体途径的凋亡通路〔10〕。本研究发现谷氨酸作用24 h后，钙蛋白酶在凋亡的细胞核中大量表达，而在胞浆和存活的细胞核中表达较少，可能是钙蛋白酶在细胞凋亡的过程中发生了核移位。本研究证明钙蛋白酶在谷氨酸作用后被大量激活，并在细胞凋亡过程中移位至细胞核，钙蛋白酶抑制剂MDL-28170对谷氨酸引起的皮质神经元损伤具有保护作用。

1 Bancila V，Nikonenko I，Dunant Y，et al.Zinc inhibits glutamate release via activation of pre-synaptic K channels and reduces ischaemic damage in rat hippocampus〔J〕.J Neurochem，2004;90(5)：1243-50.

2 Jennings JS，Gerber AM，Vallano ML.Pharmacological strategies for neuroprotection in traumatic brain injury〔J〕.Mini Rev Med Chem，2008;8(7)：689-701.

3 Peña F，Tapia R.Seizures and neurodegeneration induced by 4-aminopyridine in rat hippocampus in vivo：role of glutamate-and GABA-mediated neurotransmission and of ion channels〔J〕.Neuroscience，2000;101(3)：547-61.

4 Harris ME，Wang Y，Pedigo NW Jr，et al.Amyloid beta peptide(25-35)inhibits Na+-dependent glutamate uptake in rat hippocampal astrocyte cultures〔J〕.J Neurochem，1996;67(1)：277-86.

5 Chiu K，Lam TT，Ying Li WW，et al.Calpain and N-methyl-D-aspartate(NMDA)-induced excitotoxicity in rat retinas〔J〕.Brain Res，2005;1046(1-2)：207-15.

6 Mansouri B，Henne WM，Oomman SK，et al.Involvement of calpain in AMPA-induced toxicity to rat cerebellar Purkinje neurons〔J〕.Eur J Pharmacol，2007;557(2-3)：106-14.

7 James R，Brorson MD，Charles J，et al.Delayed Antagonism of Calpain reduces excitotoxicity in cultured neurons〔J〕.Stroke，1995;26：1259-67.

8 JinY，Yan EZ，Fan Y，et al.Neuroprotection by sodium ferulate against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3 kinase pathways〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(12)：1881-90.

9 Rami A，Volkmann T，Agarwal R，et al.β2-Adrenergic receptor responsiveness of the calpain-calpastatin system and attenuation of neuronal death in rat hippocampus after transient global ischemia〔J〕.Neurosci Res，2003;47(4)：373-82.

10 Gil-Parrado S，Fernández-Montalván A，Assfalg-Machleidt I，et al.Ionomycin-activated calpain triggers apoptosis.A probable role for Bcl-2 family members〔J〕.J Biol Chem，2002;277(30)：27217-26.