套式PCR法在肺炎支原体感染诊断中的应用

马少杰* 辛德莉

（1 民航总医院儿科，北京 100123；2 首都医科大学附属北京友谊医院儿科，北京 100050）

肺炎支原体是社区获得性呼吸道感染的常见病原之一，MP感染导致的肺炎及肺外并发症对儿童健康危害严重[1]。近些年来，临床上应用理论上对MP感染有效的药物治疗不顺利的病例报道日益增多，进而分离到耐药株[2]。本研究以套式PCR法为检测方法，早期快速诊断MP感染、指导合理用药。

1 对象与方法

1.1 临床病例诊断和入选标准

①具有急性发热、咳嗽等症状；②肺部听诊可闻中小水泡音和（或）X线检查显示肺部病灶；③血清检测MP-IgM抗体、MP-PCR或者培养阳性[3]；④入选病例签署知情同意书。

1.2 对象

2007年6月和2009年12月符合标准共计65例，男33例，女32例。年龄2～13岁，病程为（5±2.5）d。

1.3 MP-PCR检测

1.3.1 标本来源

入选病例分别采集咽拭子标本。

1.3.2 MP培养基

PPLO基础培养基，加15%新生小牛血清、10%鲜酵母浸液、0.002%酚红指示剂、1%葡萄糖及青霉素5万U/100mL。

1.3.3 PCR方法

将MP培养液浸泡的咽拭子棉签，反复挤压弃掉棉签，将浸泡液以16000r/min离心10min，弃去上清液后加标本处理液100℃处理5min提取DNA[4]。分别应用MP种特异的16SrRNA、23SrRNA基因套式PCR扩增。套式PCR试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.3.4 结果观察

取PCR扩增产物10μL与2μL溴酚兰试剂点样于2%琼脂糖凝胶中，以100伏电压电泳20～30min，出现目标区带：16SrRNA-nPCR为535bp左右为阳性，23SrRNA-nPCR为239bp左右为阳性。

1.4 肺炎支原体培养方法

将咽拭子标本初步处理后接种于MP培养基中，混匀后置于37℃温箱中孵育，如有MP生长，即发酵葡萄糖产酸，使培养基pH下降，指示剂发生颜色变化，由红变黄，可作为MP生长的指征。

1.5 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行分析，计量资料用均数±标准差进行统计学描述，对计量资料进行正态性检验，明确正态分布后再进行下一步分析。各组间率的比较采用χ2检验，检验显著性取α=0.05，P＜0.05有显著性差异。

2 研究结果

MP检测结果：65例咽拭子标本提取DNA样本行套式PCR检测，16SrRNA-nPCR 阳性率为75.4%（49例），23SrRNA-nPCR阳性率为78.5%（51例），2种方法相比，P值等于0.687，无统计学差异。阳性临床分离株和标准株（FH）套式PCR扩增产物经电泳检测后均出现MP目的条带：535bp、239bp，证实为肺炎支原体。见表1～表2和图1～图2。

分离培养得到肺炎支原体31株，与套式PCR方法相比，培养法MP阳性率47.6%，23SrRNA-nPCR法阳性率78.5%（P＜0.001）。

3 讨 论

MP是儿童和青少年社区获得性感染的常见病原体，可引起多种呼吸道疾病及肺外并发症。MP感染发病率呈增高趋势，且发病年龄也有提前趋势。目前尚无满意的、单一的能早期、快速、经济而又简易的MP感染检测诊断方法。

表1 16SrRNA、23SrRNA基因套式PCR扩增法结果比较

表2 培养法和23SrRNA nPCR法检测MP结果比较

图1 部分临床分离株23SrRNA套式PCR产物电泳图

图2 部分临床分离株16SrRNA套式PCR产物电泳图

MP检测方法主要有分离培养法、电镜法、血清学方法以及核酸探针法等。MP-IgM抗体检测应用的是酶联免疫法，但由于MP-IgM多在发病1周左右出现，因而单份血清标本多在病程满7d后检查阳性率高，不利于早期诊断。本研究中65份血清标本均采集于病程满7d后，MP-IgM结果均为阳性。分离培养法是诊断MP感染的金标准，是常用的诊断方法之一。MP培养法需要采集临床咽拭子标本，将标本接种于MP培养基中孵育，观察培养基颜色变化：如有MP生长，指示剂发生颜色变化。MP培养难度较大，且MP生长缓慢，一般于孵育7-15天后培养基出现颜色变化，因而限制应用于早期临床诊断。

MP-PCR检测法相对来说更加敏感、安全和可靠，可以与血清学和（或）培养法联合进行诊断。nPCR方法是国内外众多学者在PCR技术广泛应用的基础上，发展并形成用来研究支原体的技术。nPCR是通过“外”、“内”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外” 引物和一对在扩增产物中再扩增小片段的“内”引物的一种PCR技术。目前，nPCR技术已在组织细胞培养中的支原体污染、动物支原体病诊断和人类疾病与支原体感染中得到了广泛的应用[5,6]。

本研究采用nPCR法检测MP感染，虽然两种方法无差异，但与培养法相比，其特异性和准确性提高，利于早期诊断。由于分离MP难度较大，在一定程度上限制了临床观察的开展，本研究样本例数偏少，需要进一步扩大样本量来评价效果。

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