通络益智散对血管性痴呆大鼠行为学、海马病理学的影响*

孙红旭，戴恩来

(甘肃中医学院内科学教研室，甘肃 兰州730000)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，近年来已成为严重危害老年人身心健康的常见病、多发病，是老年期痴呆中最常见的类型之一。因此深入探讨VD 的病理生理机制以及寻求较为理想的防治药物具有重要意义。通络益智散是甘肃中医学院戴恩来教授治疗VD 的有效经验方，经过长期临床应用疗效显著。为进一步探讨该方对VD 的疗效及作用机制，本研究以大鼠为研究对象，观察该药对大鼠行为学、海马病理学的影响，以揭示其治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康Wistar 雄性大鼠60 只，体质量(250 ±20)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号:SCXK(甘)2011－0001。大鼠在自然光线、20～25 ℃环境温度下，自由进食进水，适应性饲养1 周。

1.2 药品、试剂与仪器

通络益智散药物组成:红芪、当归、地龙、红花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、远志，由甘肃中医学院附属医院提供。硝普纳粉针剂，50 mg/支，北京双鹤现代医药技术有限公司产品，批号091011;尼莫地平，20 mg/片，山西亚宝药业集团有限公司产品，批号090811。跳台仪，自制，为30 cm×30 cm×60 cm的被动回避条件反射箱，用黑色塑料板分隔成3 间，底面铺以铜栅，间距0.5 cm，可以通电，电压强度由1 个变压器控制;每间左后角置1 个高和直径均为4.5 cm 的绝缘平台(大鼠可停留在圆台上回避电击)。BCD－183 型可控低温冰箱，青岛澳柯玛股份有限公司产品;AO 病理切片机;H.H.S 21－4 型电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂产品;BX51/BX52型Olympus 系统显微镜，产地日本。

1.3 血管性痴呆模型的建立

参照蔺心敬等［1］方法改进方法。将大鼠用100 g/L水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后，颈正中部常规消毒后切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣，拉紧丝扣，阻断血流10 min 后松开丝扣使血液灌注10 min，共重复3 次;在距尾尖1 cm 处剪断放血约1 mL;热凝止血，第3 次再灌注后观察30 min 后缝合皮肤，切口局部注射庆大霉素0.2 万U，术后肌注青霉素0.2 万U/d，连续3 d。假手术组大鼠只做麻醉，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，但不阻断CCA 及腹腔注射硝普钠。整个造模过程中，用肛表密切观察大鼠肛温，保持肛温在37 ℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。

1.4 动物分组与给药

从60 只雄性Wistar 大鼠中随机选出10 只作为假手术组，其余50 只采用上述方法制造VD 模型。手术过程由于喉返神经受损、出血量过多、麻醉量太大而致6 只大鼠死亡，术后2 d 又相继死亡4 只，后再无死亡，共剩余40 只大鼠。将此40 只大鼠随机分为模型对照组、通络益智散大剂量组、通络益智散小剂量组及尼莫地平组，每组各10 只。手术后第8 天通络益智散大剂量组以通络益智散3.14 g/mL 药液灌胃，31.4 g/(kg·d);通络益智散小剂量组以通络益智散0.785 g/mL 药液灌胃，7.85 g/(kg·d);尼莫地平组以尼莫地平1 g/L 混悬液灌胃，0.010 g/(kg·d);假手术组、模型对照组给予相同剂量的生理盐水。连续给药21 d。

1.5 检测指标

1.5.1 学习、记忆能力的检测

造模后7 d 及术后4 周对大鼠进行跳台仪训练。训练前先将动物放入箱中自由活动3 min，熟悉环境，然后将动物放置在圆台上，接通铜栅电源(交流电，电压36 V)，记录动物3 min 内的错误次数(动物跳下圆台次数)及受电击总时间，作为学习训练成绩记录。24 h 后直接将动物放置在圆台上，记录其从放入至第一次下台受到电击的时间(潜伏期)、5 min 后内错误次数及受到电击总时间，作为记忆测试成绩记录。

1.5.2 海马组织病理学观察

术后第30 d 取材。用100 g/L 水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠;经心灌注37 ℃生理盐水50～100 mL，再先快后慢灌注含40 g/L 多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 值7.2)100～400 mL，30 min 灌注完毕。取出整脑，在冰盘上去除脑膜和血管，分离海马称质量，在上述固定液内浸泡12 h。40 g/L 甲醛溶液固定脑组织，石蜡包埋、冠状切片厚度(4 μm)，HE 染色，光镜下观察。HE 染色程序如下:二甲苯I、II 中各浸泡脱蜡10 min→质量分数100%、100%、95%、80%、70%乙醇各浸泡3 min→双蒸水冲洗3 min→苏木素染液中10 min→双蒸水快速冲洗→质量分数1%盐酸乙醇分色数秒→双蒸水冲洗1 min→质量分数1%稀氨水返蓝30 s→双蒸水冲洗1 min→伊红染液中1 min→双蒸水冲洗30 s→质量分数70%、85%、95%、100%乙醇逐级脱水，各浸泡3 min→二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 动物一般情况对比

模型对照组大鼠大多表现为毛发零乱、精神萎靡、进食减少、活动减少、行动迟缓;部分大鼠出现共济失调、自发运动增多或自我及互相嘶咬等症状。各治疗组大鼠在术后1 周内表现出与模型对照组类似的症状，但这些症状在1 个月内逐渐减轻。假手术组大鼠均未出现上述类似症状。

2.2 各组大鼠造模后跳台测试结果对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠的错误次数增多、受电击时间延长、触电潜伏期缩短，差别有统 计学意义(P＜0.01)，说明VD 模型成立。见表1。

表1 大鼠造模后跳台实验的学习和记忆成绩对比 ±s

表1 大鼠造模后跳台实验的学习和记忆成绩对比 ±s

注:与假手术组对比，＊＊ P＜0.01。

组 别 动物数学习成绩5 min 错误次数/次 受电击时间/s记忆成绩5 min 错误次数/次 受电击时间/s 潜伏期/s假手术组 10 2.77±0.50 20.77±2.77 1.23±0.37 13.85±2.09 70.31±8.14对照组 40 5.31±0.67＊＊ 38.54±4.16＊＊ 4.77±0.67＊＊ 30.62±2.83＊＊ 15.25±11.82＊＊

2.3 通络益智散对血管性痴呆大鼠学习、记忆能力的影响

治疗后大、小剂量的通络益智散及尼莫地平组大鼠的跳台错误次数和受电击时间明显少于模型对照组(P＜0.01 或P＜0.05)，同时大、小剂量的通络益智散及尼莫地可使VD 大鼠潜伏期明显增加(P＜0.01 或P＜0.05)。见表2。

表2 治疗后各组大鼠跳台实验的学习和记忆成绩对比 ±s

表2 治疗后各组大鼠跳台实验的学习和记忆成绩对比 ±s

注:与模型对照组对比，# P＜0.05，## P＜0.01;与通络益智大剂量组对比，△P＜0.05，△△P＜0.01;与尼莫地平组对比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组 别 动物数学习成绩5 min 错误次数/次 受电击时间/s记忆成绩5 min 错误次数/次 受电击时间/s 潜伏期/s假手术组 10 0.88±0.84## 8.38±2.30## 0.68±0.52## 7.25±2.19## 133.38±5.17#模型对照组 10 4.38±1.30＊△△ 51.88±5.75＊＊△ 2.88±1.72＊△ 50.38±5.94＊＊△ 43.00±3.92＊＊△通络益智大剂量组 10 2.13±0.99## 24.75±3.92# 1.25±0.71# 14.75±2.65# 122.25±3.05#通络益智小剂量组 10 2.50±0.93#＊ 34.75±3.74##＊ 1.13±0.99#＊ 33.13±10.49##＊ 88.63±10.74##＊尼莫地平组 10 2.75±1.03# 16.38±2.70## 1.25±0.89# 21.38±3.74## 62.63±7.87##

2.4 通络益智散对血管性痴呆大鼠海马组织病理形态的影响

假手术组:海马CA1 区锥体细胞排列紧密，细胞核圆而大、核仁清晰，神经纤维密集、排列整齐，胶质细胞无增生。模型对照组:海马神经细胞层次减少，排列稀疏，细胞核体积变小、核仁消失、深染，结构不清，成核固缩表现，胶质细胞增生形成多处结节。尼莫地平组:海马CA1 区细胞排列较模型对照组整齐，形态较正常，水肿明显减轻，海马内核固缩现象减轻，胶质细胞轻度增生。通络益智散大剂量组:与模型对照组相比改善明显，与尼莫地平组比无明显差异，海马部位水肿明显减轻，神经元轻度变性，呈现可逆性改变，胶质细胞轻度增生。通络益智散小剂量组:与模型对照组相比改善明显，与尼莫地平组略显差异，海马部位水肿减轻，神经元轻度变性，胶质细胞轻度增生。

3 讨 论

3.1 通络益智散对VD 大鼠学习、记忆功能的影响

动物错误次数、受电击时间阳性率越低，触电潜伏期越长，反映学习记忆力越强。跳台反应实验结果表明，血管性痴呆大鼠学习记忆能力明显低于正常对照组，表明该方法造成的动物模型智力明显下降，动物有一定“痴”表现。基于目前尚无与临床十分吻合的血管性痴呆动物模型，而该法造模与血管性痴呆的病因病机基本相似，因此，以此模型为基础来观察通络益智散的作用及其机制是可行的。

经用通络益智散方药治疗后，动物反应能力明显加强，即学习记忆能力明显加强，揭示该方药能明显改善血管性痴呆动物的学习记忆能力，提高其智力，这与临床应用该方药能改善智力的情况相吻合。

3.2 通络益智散对VD 大鼠脑组织病理形态的影响

海马是大脑一个重要结构，极易受损并极具可塑性。海马CA1 区锥体细胞与学习记忆密切相关亡［2］。目前认为，其神经元凋亡可能在VD 的发病过程中具有重要作用［3］。基于此，选择海马CA1 区作为研究智能的主要部位，有着极其重要的意义。

本研究发现VD 模型大鼠海马组织结构受损，病理改变与行为学变化相一致，并伴有学习和记忆能力的下降，提示反复缺血再灌注所致海马组织的神经元损伤是学习、记忆功能受损的形态学基础。本实验通过光镜观察大鼠脑组织海马结构变化，发现通络益智散能减轻海马部位水肿、神经元的变性，抑制胶质细胞的增生从而防止VD 的发生。

［1］蔺心敬，李吕力，王铁建，等. 血管性痴呆大鼠模型的制备与评价［J］.中国比较医学杂志，2006，16(12):733－735.

［2］Shaw CA，Petrik MS.Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration［J］. J Inorg Bio－chem，2009，103(11):1555－1562.

［3］Fang M，Li J，Tiu SC，et al .N－methyl－D－aspartate receptor and apoptosis in Alzheimer's disease and multiinfarct dementia［J］.J Neurosci Res，2005，81(2):269－274.