扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠腹腔感染所致肠损伤的保护作用

王丁超，高 翔，苏秀平，王 静，吴桂玲，张 韧，陈晓敏

(1.濮阳市中医院，河南 濮阳457003;2.河南省中医院，河南 郑州450002)

严重的腹腔感染可以引起肠道的损伤，出现肠麻痹、肠道内毒素淤滞、肠屏障破坏、肠道内菌群失调以及肠道细菌移位，引起代谢紊乱、免疫功能障碍以及内环境平衡破坏和肠源性感染，肠损伤在脓毒症的发生发展中起到推波助澜的作用［1－2］。扶正败毒颗粒为濮阳市中医院院内制剂，由人参、生大黄、水牛角、生地黄、麦冬、玄参、石膏、知母、黄连、冰片等组成，具有解毒降浊、益气化瘀功能，可以荡涤胃肠积滞，抗菌排毒，促进肠道蠕动，保护肠屏障，改善肠道的缺血再灌注损伤，减少肠损伤带来的肠源性内毒素血症，下调炎性介质，保护靶器官。本实验以脓毒症大鼠为研究对象，观察大鼠不同时间点的外周血白细胞计数、中性粒细胞比率、肠组织含水量、肠组织白细胞介素－ 1(IL-1)、肿瘤坏死因子－ α(TNF-α)表达变化，探讨中药复方扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠腹腔感染所致肠损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动 物

青年SD 大鼠154 只，清洁级，雌雄各半，鼠龄3～4月，体质量(300 ±50)g，由河南实验动物中心提供，动物质量合格证号:SCXK(豫)2009－0006。

1.2 药品、试剂与仪器

扶正败毒颗粒，由濮阳市中医院中药制剂室提供，批号20090605;乌司他丁，广东天普生化医药股份有限公司产品，批号S19990050。IL-1 单克隆抗体(批号BA0131，BA0962)及TNF-α 单克隆抗体(批号BA0990，BA0544)，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。PM－10AD 型光学显微镜，Olympus Optical Co.LTD 产品;JA1203 型电子天平，上海精科天平厂产品;XS－ 800i 型自动血液分析仪，日本希森美康公司产品。

1.3 分组与模型的建立

将SD 大鼠按随机数字表法分为模型对照组、扶正败毒颗粒组、乌司他丁组及扶正败毒颗粒联合乌司他丁联合组(以下简称联合组)，每组36 只，另设假手术组10 只。参考文献［3－4］加以改良建立脓毒症动物模型。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠;待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，颈部皮肤常规备皮、消毒;于颈外侧下颌至心脏的中点作1 个约1 cm 的横切口，钝性分离皮下组织，暴露右侧颈外静脉;沿血管向近心端方向插入留置针约1 cm，将导管从留置针管与颈外静脉夹孔中把心导管慢慢置入达右心房，结扎固定，导管末端经皮下隧道从颈后中央引出并固定于皮肤;管内注射125 U/mL 肝素0.5 mL 抗凝，插入置管针封闭导管;然后沿腹白线中段作3 cm切口，探查取出盲肠;用四号丝线距盲端1 cm 处结扎，用12 号针穿刺3 个孔，挤出少许粪便于腹腔内，回纳盲肠，分层缝合腹腔。假手术组仅在颈部及腹部各做1 个切口，缝合。手术过程中保持大鼠肛温(37.0 ±0.5)℃，保持室温(26 ±1)℃。

1.4 给药方法

造模后第1 日，假手术组、模型对照组、乌司他丁组用生理盐水灌胃，扶正败毒颗粒组、联合组用扶正败毒颗粒(36. 8 mg/100 g)灌胃(灌胃容积为1 mL/100 g)，每日灌胃1 次，连续7 d，直至取材;此外，乌司他丁组、联合组大鼠分别于造模后第1 天腹腔内注射乌司他丁(1 万U/kg)，假手术组、模型对照组、扶正败毒颗粒组用同等容积的生理盐水腹腔注射，每天1 次，连续7 d，直至取材。

1.5 检测指标

1.5.1 外周血白细胞和中性粒细胞比率

在造模结束后第2，3，7 d 取材。取大鼠尾部静脉血，用XS-800i 自动血液分析仪自动分析计数外周血白细胞(×109L－1)和中性粒细胞比率(%)。

1.5.2 肠组织含水量

称取肠组织湿质量，然后放入恒温箱(100 ±2 ℃)干燥，24 h 后取出，称取干质量，计算肠组织含水量。计算公式:肠组织含水量=(肠湿质量－肠干质量)/肠湿质量×100%，以%表示。

1.5.3 肠组织TNF-α、IL-1 表达

采用免疫组织化学SP 法检测。在400 倍光镜下观察，细胞膜、细胞浆呈棕色为免疫组化阳性。用Image－Pro Plus 5.1 专业图像采集与分析系统采集图像，并进行半定量分析。每张切片随机选取不重叠的5 个视野拍照，测定其平均吸光度(A)及阳性细胞数，取其平均值代表各细胞因子的表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，组内差异比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠外周血白细胞计数、中性粒细胞比率的影响

与假手术组对比，模型对照组各时间点大鼠外周血WBC 计数升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，扶正败毒颗粒组、乌司他丁组及联合组各时间点白细胞计数均降低，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。各药物组7 d时的白细胞计数均较2 d、3 d 时下降，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，以联合7 d 组下降尤为显著。外周血中性粒细胞比率变化与白细胞计数变化呈正相关。见表1。

表1 各组大鼠外周血白细胞计数、中性粒细胞比率对比 ±s

表1 各组大鼠外周血白细胞计数、中性粒细胞比率对比 ±s

注:与假手术组比较，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，# P＜0.05，## P＜0.01;与扶正败毒颗粒组对比，△P＜0.05，△△P＜0.01;与2 d 组对比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与3 d 组对比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组 别 取材时间点 动物数 白细胞计数/(×109 L －1) 中性粒细胞比率/%假手术组6 4.38 ±0.88 62.16 ±0.00造模结束第2 d 6 12.07 ±1.27＊＊ 80.53 ±1.70＊＊3 d 6 15.88 ±1.78＊＊ 91.70 ±2.46＊＊7 d 6 14.58 ±1.57＊＊ 85.24 ±2.04＊＊▲造模结束第2 d 6 8.87 ±0.92 76.18 ±1.37 3 d 6 10.60 ±1.29## 82.35 ±1.69##7 d 6 9.17 ±1.25##＊＊▲▲ 73.21 ±2.26##＊＊▲▲造模结束第2 d 6 8.25 ±0.77 77.06 ±1.60 3 d 6 9.33 ±1.11 80.39 ±1.45 7 d 6 6.75 ±1.76#△△＊＊▲▲ 72.86 ±2.27#△△＊＊▲▲造模结束第2 d 6 7.07 ±1.70 74.11 ±1.22#3 d 6 5.63 ±1.36## 70.26 ±1.94##7 d 6 ##△＊＊▲▲ ##△＊＊▲▲模型对照组 扶正败毒颗粒组 乌司他丁组 联合组 4.98 ±0.9865.37 ±1.79

2.2 扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠肠组织含水量的影响

与假手术组对比，模型对照组各时间点大鼠肠组织含水量升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组相应时间点对比，各药物组各时间点的大鼠肠组织含水量均降低，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。各药物组7 d 时的含水量均较2 d、3 d 时下降，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，以联合7 d 组下降尤为显著。见表2。

表2 各组大鼠肠组织含水量对比 ±s

表2 各组大鼠肠组织含水量对比 ±s

注:与假手术组对比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，# P＜0.05，## P＜0.01;与扶正败毒颗粒组对比，△P＜0.05，△△P＜0.01;与2 d 组对比，＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与3 d 组对比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

/%假手术组组 别 取材时间点 动物数 含水量6 72.72 ±1.39模型对照组 造模结束第2 d 6 83.22 ±1.30＊＊3 d 6 87.41 ±1.05＊＊＊7 d 6 85.64 ±1.35＊＊结束第2 d 6 81.17 ±1.49 3 d 6 82.58 ±0.82 7 d 6 80.72 ±1.30##＊＊▲▲结束第2 d 6 80.39 ±1.44 3 d 6 83.29 ±1.51#＊7 d 6 80.10 ±1.15#＊＊▲▲结束第2 d 6 79.28 ±1.77#3 d 6 81.45 ±1.26##7 d 6 78.64±1.22##△＊＊▲▲扶正败毒颗粒组 造模乌司他丁组 造模联合组 造模

2.3 扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠肠组织TNF-α、IL-1 表达的影响

假手术组肠组织少量TNF-α、IL-1 阳性表达。模型对照组2 d、3 d 和7d 时的肠组织TNF-α、IL-1表达均较假手术组增强，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与模型对照组对比，扶正败毒颗粒组、乌司他丁组的3d、7d 及联合组各时间点TNF-α、IL-1 的表达均减弱，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。各药物组3 d 时的表达均较2 d 时减弱，7 d 时的表达均较3 d 时显著减弱，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，以联合7 d 组尤为显著。见表3。

表3 各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1 阳性细胞表达对比 IOD，光密度单位，±s

表3 各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1 阳性细胞表达对比 IOD，光密度单位，±s

注:与假手术组对比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，# P＜0.05，## P＜0.01;与扶正败毒颗粒组对比，△P＜0.05，△△P＜0.01;与2 d 组对比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;与3 d 组对比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组 别 取材时间点 动物数 肠组织TNF-α 肠组织IL-1假手术组6 2.89 ±1.07 2.19 ±1.62模结束第2 d 6 19.66 ±1.12 19.38 ±1.26 3 d 6 12.59 ±2.3* 12.37 ±1.22＊＊7 d 6 10.13 ±1.08＊＊▲ 10.38 ±2.38＊＊＊▲模结束第3 2 dd 6 6 12 9..7 6 7 8±±1 1..1 52 4####1 1 3 0..2 7 3 2±±2 2..9 3 5 1#7 d 6 8.01 ±2.27##＊＊▲ 8.33 ±1.58#＊▲模结束第2 d 6 14.23 ±2.53# 15.63 ±2.63#3 d 6 10.93 ±1.46# 10.29 ±2.99＊7 d 6 9.56 ±1.41##＊▲ 9.11 ±1.46＊＊▲模结束第2 d 6 7.49 ±1.77## 9.22 ±1.13##3 d 6 6.93 ±1.88## 8.16 ±2.24##△7 d 6 5.88 ±1.66##△△＊＊▲▲ 6.24 ±2.32##△△＊＊▲▲模型对照组 造扶正败毒颗粒组 造乌司他丁组 造联合组 造

3 讨 论

脓毒症属中医学“伤寒”、“温病”的范畴，由于邪毒入侵(如严重感染、中毒、休克等)或各种创伤(如外伤、烧伤、烫伤、手术等)导致正邪交争、正气耗伤、邪毒阻滞而发病。正气亏虚、浊毒内蕴、络脉瘀滞是脓毒症的主要病机之一。正气不足、毒邪内蕴陷于营血，使络脉气血营卫运行不畅，而致毒热、瘀血、浊毒瘀滞络脉，进而使各脏器受邪而损伤，引发本病。本病的病机特点为本虚标实，本虚以气虚为主势以缓，标实则以浊毒(热毒、瘀毒、浊毒)为主势以急，虚、瘀、毒交互影响，形成恶性循环。故治疗宜以清热解毒、降浊化瘀为主，兼顾益气扶正。解毒降浊，导毒邪下行，使热清、瘀化、浊去，从而使邪去正安，机体阴阳平衡状态得以恢复。扶正败毒颗粒由人参、生大黄、水牛角、生地黄、麦冬、玄参、石膏、知母、黄连、冰片等组成。方中大黄既可解毒降浊以釜底抽薪，又可化瘀通络，为君药。人参扶正大补元气并防大黄攻下之峻烈，水牛角清解营分之热毒，寒而不遏，且能散瘀，二者共为臣药。石膏配知母取白虎义，有清热保津之功;水牛角配生地黄清热凉血、活血散瘀，以防血与热结;黄连苦寒，清热解毒，以治气营两燔、气血两燔之证;麦冬、生地黄、玄参滋养阴液是为热甚伤阴而设;以上共为佐使药。诸药配伍，共奏解毒降浊、益气化瘀之功效。本研究显示，经过扶正败毒颗粒治疗，脓毒症大鼠外周血白细胞总数及中性粒细胞比例降低，提示扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠具有明显的抗炎作用。

IL-1 能够引起多种炎症因子的产生和释放，TNF-α 是全身炎症反应早期的重要炎性细胞因子，其大量释放则对机体造成损伤，二者协同可促进血管内皮、白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎症细胞进入肠道病变部位，增加血管内皮通透性，加重多器官损伤［5－6］。因此，可以通过抑制IL-1、TNF-α 的释放而减少全身的炎症反应和多脏器损害，从而对机体起保护作用。本研究结果显示，脓毒症大鼠肠组织IL-1、TNF-α 的阳性细胞数和平均光密度均增高明显，表明IL-1、TNF-α 参与了脓毒症的病理损伤过程，可能在脓毒症大鼠的病理生理中占有重要地位。扶正败毒颗粒、乌司他丁及联合用药后明显降低了IL-1、TNF-α 在肠组织的表达，联合组效果尤为显著，这可能与扶正败毒颗粒、乌司他丁通过对机体内毒素的清除，降低细胞因子IL-1、TNF 的产生，抑制和减少炎性因子的合成和释放，使其无法相互协同促进炎症反应，从而能够改善肠组织损伤。

综上所述，促炎因子TNF-α 及IL-1 在腹腔感染所致肠损伤中发挥了重要作用。扶正败毒颗粒能够降低外周血白细胞计数及中性粒细胞比率，降低脏器组织中TNF-α、IL-1 表达水平以减轻脏器损伤，减轻了肠组织的含水量，对脓毒症大鼠具有确切的治疗作用。此为扶正败毒颗粒防治脓毒症性多器官功能障碍综合征提供了参考。另外，此对探讨中西医结合治疗脓毒症的干预策略具有重要意义。

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