HPLC法测定盐酸帕唑帕尼片含量和有关物质

赵玲，赵春才，杨博，刘艳艳，施琳

（1.武汉工业学院生物与制药工程学院，武汉4 3 0 0 2 3；2.南京科瑞翔医药科技有限公司，南京 2 1 0 0 1 9；3.南京安格医药化工有限公司，南京 2 1 0 0 0 9）

HPLC法测定盐酸帕唑帕尼片含量和有关物质

赵玲1＊，赵春才2，杨博3，刘艳艳2，施琳2

（1.武汉工业学院生物与制药工程学院，武汉4 3 0 0 2 3；2.南京科瑞翔医药科技有限公司，南京 2 1 0 0 1 9；3.南京安格医药化工有限公司，南京 2 1 0 0 0 9）

目的：建立测定盐酸帕唑帕尼片中主药和有关物质含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18，流动相为乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸铵缓冲液（3 5∶6 5），流速为1.0 mL·min－1，检测波长为2 6 8 nm，柱温为2 5℃，进样量为2 0 μL。结果：盐酸帕唑帕尼检测浓度线性范围为4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1（r＝0.9 9 99），检测限为2ng，平均回收率为9 9.6 0%，RSD＝0.5 3%（n＝9）。结论：该方法操作简便、快捷、准确、可靠，可用于盐酸帕唑帕尼片的质量控制。

盐酸帕唑帕尼片；有关物质；含量测定；高效液相色谱法

盐酸帕唑帕尼（Pazopanib hydrochloride，PH）是由葛兰素史克公司研制开发的第2代多靶点酪氨酸激酶抑制剂，商品名为Votrient，2 0 0 9年1 0月1 9日由美国FDA宣布批准上市，用于晚期肾癌的治疗[1]。目前其上市剂型有片剂，但该制剂的含量及有关物质测定国内未见文献报道。为此，笔者建立了测定PH片含量的高效液相色谱（HPLC）法，以为其质量评价和标准的建立提供科学依据。

1 仪器与试药

HPLC仪，包括LC-1 0 ATvp泵、SPD-1 0 Avp紫外检测器、N2 0 0 0色谱工作站、UV-2 4 0 1 PC紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。

PH片（批号：1 1 0 3 2 2 1、1 1 0 3 2 2 2、1 1 0 3 2 2 3，规格：每片2 0 0 mg）、PH对照品（由批号为1 1 0 3 0 7的原料药精制而成，纯度：9 9.8 3%）及中间体Ⅰ[N-（2-氯嘧啶-4-基）-2，3-二甲基-2 H-吲哚-6-胺]、中间体Ⅱ[2，3-二甲基-N-（2-氯嘧啶-4-基）-N-甲基-2 H-吲哚-6-胺]均由南京科瑞翔医药科技有限公司提供；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（2 5 0 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸铵缓冲液（1.5 4 3 g醋酸铵，溶于1 0 0 0 mL水中）（3 5∶6 5），流速：1.0 mL·min－1；检测波长：2 6 8 nm；柱温：2 5℃；进样量：2 0 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品与对照品溶液。取PH片粉末适量，约相当于PH 2 0 mg，精密称定，置于1 0 0 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，过滤，取续滤液作为供试品溶液；另取PH对照品，同法用流动相溶解并制成0.2 mg·mL－1的溶液作为对照品溶液。

2.2.2 有关物质溶液。取PH片粉末适量，按“2.2.1”项下方法制成PH浓度为0.2 mg·mL－1的溶液作为供试液；取供试液适量，用流动相稀释制成2 μg·mL－1的溶液作为对照液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2.1”项下对照品、供试品溶液各2 0 μL，并以空白辅料的流动相溶液作为阴性对照，分别进样分析。结果，PH的理论板数为8 5 9 4，保留时间为8.4 0 2 min，峰形对称，详见图1。

2.4 线性关系与检测限考察

取PH对照品，用流动相溶解并稀释成浓度分别为4 0.1 8、1 2 0.5、2 0 0.9、2 8 1.3、3 6 1.6 μg·mL－1的溶液，分别精密量取上述溶液进样，记录色谱。以浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为A＝－2.5 2 49×1 04+2.4 6 15×1 04c（r＝0.9 9 99，n＝5）。结果表明，PH检测浓度的线性范围为4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1。以信噪比S/N＝3计算，得检测限为2 ng。

2.5 精密度试验

取对照品溶液连续进样6次，测定。结果，峰面积值RSD＝0.2 7%。

2.6 重复性试验

精密称取同批样品6份，制备成供试品溶液，进样分析，测定每份样品的含量，结果平均含量为9 9.1 3%，RSD＝0.3 0%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液1份，在0、1、2、4、8 h时分别进样，结果以峰面积计算RSD＝0.2 8%，表明供试品溶液在8 h内相对稳定。

2.8 回收率试验

取同批样品，按测试浓度的8 0%、1 0 0%、1 2 0%3个梯度分别加入PH对照品，进样分析，计算回收率，结果详见表1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图A.空白辅料；B.对照品；C.供试品；1.PHFig 1 HPLC chromatograms of system suitability test A.blank excipients；B.substance control；C.test sample；1.PH

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.9 中间体分离试验及破坏性试验

取PH对照品及中间体Ⅰ、Ⅱ用流动相制成每1 mL中含PH 2 0 0 μg、中间体Ⅰ2 0 μg、中间体Ⅱ2 0 μg的溶液，作为中间体分离试验的供试品溶液。另取PH片粉末（约相当于PH 1 mg）各3份，分别置于1 0 mL量瓶中，第1份加0.1 mol·L－1的盐酸1 mL；第2份加0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液1 mL；第3份加3%的双氧水1 mL。静置2 h后，第1份加0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液1 mL中和后，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为酸破坏后的供试品溶液；第2份加0.1mol·L－1的盐酸1 mL中和后，加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为碱破坏后的供试品溶液；第3份加流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为氧化破坏后的供试品溶液。取上述各供试品溶液进样分析，记录色谱图。结果各中间体的峰与主峰能完全分离，酸、碱破坏没有产生明显的降解产物，氧化破坏有明显的降解产物，且各降解产物都能与主成分完全分离。中间体分离及氧化破坏后溶液色谱图见图2。

图2 中间体分离及氧化破坏试验高效液相色谱图A.中间体分离试验供试品；B.氧化破坏后供试品Fig 2 HPLC chromatograms of intermediate separation and destructive oxidation test A.test sample of intermediates separation test；B.test sample of destructive oxidation test

2.10 样品含量测定

主药含量的测定：取PH片粉末及PH对照品适量，按“2.2.1”项下方法分别制备成供试品、对照品溶液，分别进样，记录峰面积，并按外标法以峰面积计算含量。结果3批样品含量分别为9 9.1 3%、9 9.4 9%、9 8.9 4%。

有关物质含量的测定：取PH片粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备成供试液和对照液。量取对照液2 0 μL注入色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使PH峰的峰高为满量程的1 0%～3 0%；再量取供试液2 0 μL注入色谱仪，记录色谱至主峰保留时间的3倍，记录主峰和有关物质的峰面积，按1%自身对照法计算有关物质的含量。结果3批样品中有关物质含量分别为0.2 8%、0.3 3%、0.2 5%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取PH对照品、供试品、中间体和辅料溶液，按紫外分光光度法[2]操作，于1 9 0～4 0 0 nm波长范围内进行扫描。结果，对照品、供试品溶液均于2 1 0、2 6 8、3 2 3 nm波长处有最大吸收，合成反应各步的中间体于2 6 8 nm波长处均有最大吸收，辅料溶液在此处无吸收，故检测波长选为2 6 8 nm。

3.2 流动相的选择

通过对PH、各中间体及破坏后样品的测定，发现以乙腈-0.0 2 mol·L－1醋酸铵缓冲液（3 5∶6 5）为流动相时，主成分峰形对称，与其有关物质、各步中间体和降解产物均能得到很好的分离。

综上所述，本方法操作简便、快捷、准确、可靠，可用于PH片的质量控制。

[1] FDA.FDA approves new treatment for advanced form of kidney cancer[EB/OL].http：//www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm1 8 7 1 7 4.htm.2 0 0 9-1 0-1 9.2 0 1 1-0 8-1 4.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2 0 1 0年版.北京：中国医药科技出版社，2 0 1 0：附录ⅣA.

Content Determination of Main Component and Related Substances in Pazopanib Hydrochloride Tablets by HPLC

ZHAO Ling（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 4 3 0 0 2 3，China）
ZHAO Chun-cai，LIU Yan-yan，SHI Lin（Nanjing Keruixiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing 2 1 0 0 1 9，China）YANG Bo（Nanjing Ange Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing 2 1 0 0 0 9，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the content determination of main component and related substances in Pazopanib hydrochloride tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18column with mobile phase composed of acetonitrile-0.0 2mol·L－1ammonium acetate solution（3 5∶6 5）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 2 6 8nm at 2 5℃.The injection size was 2 0μL.RESULTS：The linear range of pazopanib hydrochloride was 4 0.1 8～3 6 1.6μg·mL－1（r＝0.9 9 99）.The detection limit was 2ng and average recovery rate was 9 9.6 0%（RSD＝0.5 3%，n＝9）.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate and reliable，and it is applicable for the quality control of Pazopanib hydrochloride tablets．

Pazopanib hydrochloride tablets；Related substance；Content determination；HPLC

R9 2 7.2

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 1 3 8-0 2

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.2 6

＊讲师，博士。研究方向：天然药物化学、药物化学。电话：0 2 7-8 3 9 5 6 7 9 3。E-mail：zhaolingcpu@1 2 6.com

2 0 1 1-0 9-1 9

2 0 1 1-1 0-2 6）