荧光定量PCR技术对前驱期小儿结核性脑膜炎的应用价值

刘彦轩 贾安奎 郭盛菊 石太新 尚好珍

结核性脑膜炎（简称“结脑”）是由Mt b侵入蛛网膜下腔引起软脑膜、蛛网膜病变，进而累及脑实质和脑血管的神经系统结核病，是小儿最常见和最严重的肺外结核病之一，死亡率高达30%～50%，存活患儿中约20%～50%遗留永久性神经系统后遗症（偏瘫、失语、失明等），若早期诊断和及时合理治疗，大多数患者可获痊愈，因此早期诊断是决定患儿预后的关键因素［1］。但目前临床诊断结脑，多依靠病史、症状、体征、试验性治疗及实验室检查等综合性指标来判定，传统实验方法如涂片、培养和结核抗体检测等方法难以满足临床早期诊断的需要。陈效友等［2］报道以Taq酶标记的FQ-PCR检测痰和血标本中Mt b灵敏度高达10-18kg DNA和1～5个菌体／ml，比普通PCR高10～100倍。为进一步研究其对结脑早期诊断、疗效评估及与预后的关系、作用和意义，笔者做了以下探讨，以期为临床提供诊疗思路和积累试验数据，现报告如下。

对象和方法

一、研究对象

2007年3月至2011年2月间河南省结核病医院结核内科和河南省新乡医学院第一附属医院豫北儿科诊疗中心5个小儿内科的住院患儿共147例。纳入研究的小儿分为结脑组和对照组。

1．结脑组：为前驱期结脑患儿，共117例。其中男61例，女56例；年龄6个月至7岁，中位年龄2．2岁，平均2．4岁。纳入标准：患有肺结核或有与活动性结核病患者密切接触史的患儿，烦躁、精神萎靡、呆滞、嗜睡、消瘦或体质量不增、低热，不明原因反复呕吐，婴幼儿皱眉、以手击头、啼哭，年长患儿自诉头疼，无抗结核治疗史且脑脊液Mt b培养阳性（符合“金标准”）。排除标准：脑脊液 Mt b培养阴性，即选例时疑似结脑患者，治疗前采集脑脊液检测，随即进行治疗，若培养Mt b阴性则不计入本组研究范围。

2．对照组（非结脑组）：30例，男女各15例；年龄5个月至6．5岁，中位年龄2．4岁，平均2．7岁。为我院小儿内科诊断为非结核分枝杆菌感染的脑膜炎或其他脑炎的住院患儿，纳入标准：根据临床表现、体征，脑脊液蛋白质、氯化物、葡萄糖等生化指标的变化，以及细胞种类和计数，一般抗生素治疗有效或脑脊液中查到特异性病毒抗体Ig M，或培养出一般细菌［3］，且脑脊液培养 Mtb阴性。病种包括：病毒性脑膜炎18例、化脓性脑膜炎6例、隐球菌脑膜炎5例、流行性乙型脑炎1例，此几种疾病诊断符合参考文献［4］的诊断。治疗前采集脑脊液，再治疗，若Mtb培养阳性或并发结脑者，则不计入该组研究范围。

3．两组一般临床资料比较：各组间年龄、性别、体质指数（body mass index，BMI）差异无统计学意义（P 值均＞0．05），具有可比性（表1）。

表1 各组一般临床资料比较

二、研究方法

治疗前无菌采集所有疑似结脑患儿和对照组患儿脑脊液分别置于2个无菌试管，每管2 ml。均置4℃冰箱过夜，由另一实验员通过数字表法随机编号，一管取薄膜层接种培养，另一管进行FQ-PCR检测，记录培养和Mtb DNA结果，按上述纳入标准选择结脑组117例和对照组30例患儿，比较各统计指标。

结脑组患儿抗结核治疗3周后，再行培养和FQ-PCR检测，分别计算阳性检出率。

对结脑组患儿出院时培养和FQ-PCR阴性者，随访观察2年并记录复发情况；随访78例患者，另外32例未达随访时间继续观察，7例失访。其治愈的标准是：（1）临床症状、体征完全消失，无后遗症。（2）脑脊液常规检查正常（脑脊液外观、细胞数、蛋白质、糖、氯化物等）。（3）疗程结束后随访观察2年无复发。

结核性脑膜炎临床诊断的“金标准”是脑脊液Mtb涂片或培养阳性。快速Mtb培养采用美国BD公司生产的BACTEC T M MGITTM960全自动分枝杆菌检测系统和配套培养基及相关试剂，培养和鉴定周期平均12 d。

FQ-PCR仪器为中山大学达安基因股份有限公司生产DA7600型扩增仪，相关试剂由该公司提供。标本处理如下：取脑脊液薄膜层100μl加入等量DNA浓缩液（主要成分为聚乙二醇600、Na Cl），振荡数秒，9900×g离心10 min，弃上清液后加入50μl DNA提取液［主要成分为Na OH、Tris-HCl、Triton X-100、NP-40、Chelex-100、乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）］，于干式恒温器（中山大学达安基因股份有限公司生产，型号：K30B）100℃恒温浴10 min。以9900×g离心10 min，取上清液2μl加入毛细管进行PCR反应，每批加有阴、阳性质控品和4个浓度的TB阳性定量参考品（结核分枝杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供），扩增检测步骤按试剂盒操作说明进行，扩增曲线呈s型，且Ct值＜30，Mt b-DNA含量＞5．0×101拷贝／ml为阳性。

FQ-PCR检测灵敏度、特异度、诊断指数、阳性预测值、阴性预测值指标见参考文献［5］。

三、统计学处理

结 果

一、二组FQ-PCR检测与金标准比较

金标准培养结果：结脑组（培养阳性117例），对照组（培养阴性30例）。

收集整理初诊患儿符合条件的117例结脑组和30例对照组FQ-PCR检测结果发现，结脑组FQPCR均为阳性，对照组FQ-PCR阴性29例，阳性1例（表2）。

表2 两组FQ-PCR检测与金标准结果比较（例）

FQ-PCR检测与金标准比较灵敏度100．0%（117／117），特 异 度 96．7% （29／30），诊 断 指 数196．7%（100．0%＋96．7%）＞170．0%，阳性预测值99．2%（117／118），阴性预测值100．0%（29／29），符合率99．3%（146／147）。FQ-PCR检测结果与金标准采用四格表评价模式进行比较，差异无统计学意义（χ2＝0．000，P＝1．000）；相关性分析r＝0．9790，二者有相关关系（χ2＝140．9，P＝0．000）。

二、结脑组患儿抗结核治疗3周后复检结果

117例结脑组患儿抗结核治疗3周后复检，培养法、FQ-PCR法检测阳性例数分别为32例和68例，阳性检出率分别为27．35%（32／117）和58．12%（68／117）。两者阳性率差异有统计学意义（χ2＝22．63，P＝0．000）。患儿临床症状均有不同程度好转，其中有42例患者临床症状基本消失，与FQPCR检测阴性例数较为接近，此42例患儿的培养法和FQ-PCR法检测结果均为阴性，培养法检测阳性的32例患儿包含在FQ-PCR法检测阳性的68例中。

三、随访患儿复发情况

笔者对结脑组患儿出院时培养法和FQ-PCR检测阴性的患儿进行了随访，观察2年后复发情况。共随访78例患儿，另外32例未达随访时间，7例失访。此78例患儿出院时培养法均为阴性，FQ-PCR法69例阴性，9例阳性。随访结果为培养法阴性的78例患儿有7例复发（8．97%），FQ-PCR阴性69例患儿0例复发，差异有统计学意义（χ2＝4．6736，P＝0．0306）。FQ-PCR检测阳性的9例中有7例复发。

讨 论

脑脊液病原体培养是实验诊断结脑的“金标准”，但结核患儿脑脊液中由于含菌量低、菌活力低以及L型菌（Mt b的一种细胞壁缺陷变异型）的出现等细菌生物学性状的改变［6］，很容易漏诊，加之培养所需时间长，通常4～8周出结果，且灵敏度低，严重影响了结核病的早期诊断和及时治疗［7］，无法满足临床早期诊断结脑的需要。早期结脑的病死率不足10%，但晚期可达60%以上［8］。因此，准确、快速诊断结脑是治疗和预后的关键，Deshpande等［3］认为PCR是首选，它在结脑处于非常初期阶段就可以诊断［9］。

笔者采用FQ-PCR对结脑组和对照组与金标准进行了盲法对比的研究，各组间年龄、性别、BMI差异无统计学意义（P＞0．05），具有可比性。在经金标准确诊的117例结脑患儿中，FQ-PCR检测全部为阳性，敏感度为100．0%，非结脑组（对照组）检出1例阳性，特异度为96．7%，灵敏度高于文献［10-11］的90%和94．4%，特异度低于二者的100．0%。Deshpande等［3］观察到PCR扩增的灵敏度和特异度在临床标本之间差异较大，在不同的实验室，从50%～90%和60%～100%。作者认为上述文献低灵敏度的原因可能是所选用患者标准不同（本研究所选患者组均为Mtb培养阳性，灵敏度达100．0%），同时与PCR方法、探针不同，脑脊液中低负荷DNA或者细胞壁坚韧目标DNA分离困难［12］、脑脊液量不足、脑脊液中存在抑制扩增的物质［11］、以及细胞裂解或在纯化过程中DNA提取方法不同所致，实验防污染措施不到位也会导致特异度降低。FQ-PCR在PCR反应体系中加入荧光化学基团，Taq Man探针对目标序列特异性高，特别适用于单核苷酸多态性（SNP）的检测［13］，FQ-PCR 全“封闭”式的操作、d UPT-UNG酶防污染体系的设立，在相当的程度上解决了普通PCR难以避免的实验污染问题。FQ-PCR荧光检测比普通PCR后的电泳检测灵敏度要高2～3个数量级［14］，而传统的涂片抗酸杆菌染色检查需每毫升痰标本达到5000～10 000条菌以上才可能检出［15-16］，培养法的灵敏度可达10条／ml，但一般需要4～8周才能报告结果［16］，FQ-PCR检测痰和血标本中Mtb灵敏度高达10-18kg DNA和1～5个菌体／ml，无疑可以提高方法的灵敏度和特异度，达到早期诊断的目的。本文所选患儿均为前驱期结脑患儿，诊断指数达196．7%，符合率为99．3%，阳性预测值为99．2%，阴性预测值则为100．0%，r＝0．9790，提示 FQ-PCR在诊断性试验评价真实性的诊断效能指标和应用价值的统计指标，以及可靠性方面，均取得较佳效果。而文献［10］灵敏度仅为50%，可能与方法、试剂和患者选择（患者平均年龄为38岁，60%的患者为男性，而且72%的患者为HIV阳性）有关。

117例结脑组患儿治疗3周后2种方法同时检测，培养法阳性率为27．35%，FQ-PCR为58．12%，两者差异有统计学意义。这是因为药物治疗改变了细菌的生物学活性，抑制了Mt b生长，致使阳性率下降；而FQ-PCR检测的是Mtb特异性基因片段，只要没有引起检测位点基因突变，理论上都可以检测出阳性结果。因而可以分析出，FQ-PCR法在监测药物对Mt b清除效果方面，更符合机体实际情况，而且可以精确了解Mt b复制及含量。

为更进一步了解2种方法对疗效和预后评估的作用和意义，笔者对结脑组出院时2种方法各自检测阴性患儿做了随访工作，培养法检测阴性78例患儿有7例复发，FQ-PCR阴性69例患儿均无复发，差异有统计学意义。78例培养阴性的患儿除了FQ-PCR同为阴性的69例外，还有9例FQ-PCR检测阳性，9例中有7例复发，2例含量较低的患儿未复发。笔者发现复发患儿是因为治疗效果不佳还存在Mtb，而培养法又检测不到，误认为治愈所致。提示尽管培养法检测阴性，由于本身灵敏度差及其药物治疗的影响，未必脑脊液中就没有Mtb存在，而FQ-PCR因为其高灵敏度，在预后评估方面更具说服力。

综上所述，笔者认为FQ-PCR检测脑脊液Mt b DNA准确、简便、快速，对早期结脑诊断、治疗具有独特的优势，对疗效监测和预后评估比培养法更具实际应用价值。本研究不足之处在于，文中只分了培养阳性结脑组和非结脑组两组患儿，没有将培养阴性的结脑患儿进行比较分析，若都计算在内，尽管FQ-PCR阳性率会降低，但也许更能体现其作用和价值，这一问题有待今后进一步研究探讨。

［1］朱渝，葛艳玲，范娟，等．聚合酶链反应与点状免疫结合法在小儿结核性脑膜炎诊断中比较．临床儿科杂志，2006，24（7）：607-610．

［2］陈效友，王洪平，金玉生，等．Taq Man聚合酶链反应技术检测结核分枝杆菌DNA及其临床应用．中华结核和呼吸杂志，2000，23（5）：284-288．

［3］Deshpande PS，Kashyap RS，Ra mteke SS，et al．Evaluation of t he IS6110 PCR assay f or t he rapid diagnosis of t uberculous meningitis．Cerebr ospinal Fluid Res，2007，4：10．

［4］薛辛东，李永柏．儿科学．北京：人民卫生出版社，2002：351-360．

［5］刘勖．评价临床诊断性试验统计方法之二——真实性指标的统计推断．临床荟萃，1997，12（22）：1055-1056．

［6］Baran J Jr，Riederer K M，Khatib R．Li mits of detection of Mycobcteriu mtuberculosis in spiked celebr ospinal fl uid using t he poly merase chain reaction in tuberculous meningitis．Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2000，19（1）：47-50．

［7］李秀武，刘建强，郑荣坤，等．FQ-PCR技术在肺外结核中的诊断价值．中国防痨杂志，2010，32（12）：818-821．

［8］杨茜，张伦理，邬小萍．结核感染T细胞斑点试验在结核性脑膜炎早期诊断中的意义．中华传染病杂志，2010，28（8）：504-506．

［9］Desai D，Nataraj G，Kulkarni S，et al．Utility of the poly merase chain reaction in t he diagnosis of tuberculous meningitis．Res Micr obiol，2006，157（10）：967-970．

［10］Gali mi R．Extrapul monar y tuberculosis：tuberculous meningitis new develop ments．Eur Rev Med Phar macol Sci，2011，15（4）：365-386．

［11］Dora JM，Geib G，Chakr R，et al．Poly merase chain reaction as a usef ul and si mple tool for rapid diagnosis of t uberculous meningitis in a Brazilian tertiary care hospital．Braz J Infect Dis，2008，12（3）：245-247．

［12］Kusu m S，Aman S，Pallab R，et al．Multiplex PCR f or rapid diagnosis of tuberculous meningitis．J Neurol，2011，258（10）：1781-1787．

［13］李国利．实时荧光定量PCR技术及在结核病诊断实验室的研究和应用．临床肺科杂志，2008，13（10）：1315-1317．

［14］张为民，龚文波．荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的比较．实用医学杂志，2010，26（23）：4272-4274．

［15］杨珊明，周建芳．多指标联合检测同时阳性对菌阴肺结核的诊断价值．中国预防医学杂志，2007，8（3）：275-277．

［16］曹晓慧，张媛媛，万康林．PCR技术在结核病诊断中的应用．中国人兽共患病杂志，2005，21（12）：1110-1113．