卡利比克毕赤酵母活细胞制剂加工工艺的研究

庞水秀，张红印，杨其亚，赵利娜

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013)

卡利比克毕赤酵母活细胞制剂加工工艺的研究

庞水秀，张红印*，杨其亚，赵利娜

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013)

分别对卡利比克毕赤酵母的活细胞液体和固体剂型产品的加工工艺进行研究。利用磷酸缓冲溶液添加0.01%维生素C和2.5%海藻糖制备的卡利比克毕赤酵母液体制剂在20℃保藏15d仍然保持81.8%存活率。利用微波真空干燥技术在真空度8kPa，功率先为200W，后为100W，然后再进行真空干燥，得到含水量9.4%，活细胞率为100%的活性干酵母，经过4℃保藏3个月仍然保持84.8%存活率。无论采用液体制剂还是固体制剂，在保藏后对水果的病害仍具有良好的生物防治效果。

生物防治，卡利比克毕赤酵母，液体制剂，固体制剂，微波真空干燥

水果病害一直是水果贮藏的重要课题。尽管目前有高效杀菌剂和先进的贮藏技术，但在发展中国家每年因病害造成的水果损失依然高达50%，即使美国这样的发达国家每年也有10%～30%的新鲜产品由于采后病害而导致腐烂。我国水果采后损失为20%～30%左右［1-2］。防治水果采后病害的传统方法是使用化学杀菌剂，但水果上的化学杀菌剂残留会对人体健康造成影响。使用非化学的、非选择性的杀菌剂控制水果采后病害将是以后的发展方向。近年来美国、意大利等发达国家生物防治研究已经取得了阶段性的成果，生物防治的应用潜力巨大，使其可能成为取代化学杀菌剂的有效方法［3］。本实验室所筛选的卡利比克毕赤酵母是一种安全无毒，对人体无害，且对草莓、桃子等水果采后病害具有显著的防治效果的拮抗酵母。新型水果采后生物防腐保鲜剂作为一种活菌制剂，必须保证成品中有一定数量的活菌，需要好的活细胞制剂生产工艺。生物防腐保鲜剂可以制备成固体和液体剂型。其中固体型制剂具有保藏期长、易于运输等优点，因此它是目前活菌制剂的比较流行的剂型。菌体干燥的主要方法有流化床干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等多种方法，本实验创新地应用真空微波干燥炉来制备高活性的活菌制剂。而液体型制剂更方便于使用，因为其工艺简单、成本低也就成为了目前的研究热点。在液体方法保存方面，有研究表明磷酸缓冲液添加海藻糖或者半乳糖能使Candida sake或Pichia anomala保持高活性［4-6］。本实验在前人研究的基础上尝试添加几种保护剂制备高活性的液体型制剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

拮抗菌 卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)，由本实验室分离、筛选于无公害生态果园;病原菌葡枝根霉(Rhizopus stolon)，为本实验室从腐烂水果表面分离得到。

NJ207-型微波真空干燥炉 南京杰全微波设备有限公司;LRH-150型生化培养箱 上海一恒实验仪器有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液体型制剂的制备方法研究

1.2.1.1 卡利比克毕赤酵母生产培养 采用锥形瓶液体培养基发酵，在28℃，振荡速度200r/min下培养48h，所用的锥形瓶大小为1L，培养基装液量为500mL，初始的菌浓度为104cfu/mL，所述的培养基为按下述比例配制的混合液:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，115℃，灭菌15min。

1.2.1.2 卡利比克毕赤酵母液体型制剂的制备工艺研究 将培养好的卡利比克毕赤酵母发酵液装入离心杯中，4000r/min离心15min，除去上清液，无菌水清洗，再离心得到菌体沉淀，然后加入0.05mol/L的磷酸缓冲液制成菌悬液，备用。

a.维生素C对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响:使用0.05mol/L的磷酸缓冲液稀释，并用血红细胞计数板将备好的溶液中菌体浓度调至5×108cfu/mL，然后溶液中添加2.5%海藻糖，将酵母悬浮液溶液均匀分装在六个锥形瓶中。在每个锥形瓶中分别添加0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的维生素C，把每瓶溶液均匀分装在10mL的试管中，每支5mL。然后保存于25℃温度下。初始的活菌数是通过平板计数法确定的。在15d后通过平板计数法得出各组的活菌数，最终得出其存活率。本实验重复两次，每次作两个平行处理。

b.海藻糖对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响:使用0.05mol/L的磷酸缓冲液稀释，并用血红细胞计数板将备好的溶液中菌体浓度调至5×108cfu/mL，在酵母悬浮液溶液添加0.01%维生素C然后均匀分装在六个锥形瓶中。在每个锥形瓶中分别添加0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%的海藻糖，把每瓶溶液均匀分装在10mL的试管中，每支5mL。然后保存于25℃温度下。初始的活菌数是通过平板计数法确定的。在15d后通过平板计数法得出各组的活菌数，最终得出其存活率。本实验重复两次，每次作两个平行处理。

1.2.1.3 储藏后卡利比克毕赤酵母液体型制剂的生防效果研究

a.生防效果:用打孔器在草莓赤道的部位打1个直径3mm深3mm的伤口，每个草莓打2个伤口。按要求用移液器分别加入储藏后的酵母制剂(稀释到1×108cfu/mL)和新鲜酵母悬液(浓度1×108cfu/mL) 30μL，无菌蒸馏水作为对照组实验。常温下放置2h，分别把30μL葡枝根霉(Rhizopus stolon)孢子菌悬液(浓度为5×103个/mL)接种到伤口上。经过上述处理的草莓有序地放置在塑料筐里，并用保鲜膜进行密封，以保持筐内湿度。然后储存在20℃下，2d后测定由葡枝根霉引起的草莓果实发病率。每组实验用15个果实，实验重复3次。

b.生长动态:用打孔器在草莓赤道的部位打1个直径3mm深3mm的伤口。按要求用移液枪分别加入储藏后的酵母制剂(稀释到1×108cfu/mL)和新鲜酵母悬液(浓度1×108cfu/mL)30μL，将草莓置于塑料篮子中，用保鲜膜进行密封，以保持筐内湿度。然后储存在20℃下，每隔一段时间取样测定水果伤口处的卡利比克毕赤酵母数。

水果伤口处的卡利比克毕赤酵母数测定方法为:在酒精灯火焰下挖下伤口，放入装有50mL无菌水的锥形瓶中，用无菌玻璃棒打碎水果伤口部分，使其均匀分布于溶液中。将溶液用无菌水进行梯度稀释，分别用移液器取0.1mL注在NYDA培养基平板上，用灭过菌的涂布棒涂布均匀，置于28℃的培养箱中培养2d，取出，数菌落数，计算每个水果伤口的卡利比克毕赤酵母数。

1.2.2 固体型制剂的制备方法研究

1.2.2.1 卡利比克毕赤酵母生产培养 同1.2.1.1。

1.2.2.2 微波真空干燥卡利比克毕赤酵母 取发酵后菌液4000r/min离心10min，弃上清液，无菌水反复清洗2次，获得酵母乳液。司班60用80～90℃的热水配制，可按每100mL水里加12.5g配制，配好后保持65～70℃，按2%(w/w)的添加量加入酵母乳中，并保证混合均匀。称取卡利比克毕赤酵母乳液96.16g，放入微波炉专用塑料盒，真空度8kPa。

a.200W微波功率干燥26min，过程中待含水量少于40%时，取出物料将其打散，以免干燥后结成硬块，然后继续干燥。

b.100W微波功率干燥54min，过程中待含水量少于40%时，取出物料将其打散，以免干燥后结成硬块，然后继续干燥。

c.200W微波功率干燥12min，100W微波功率干燥16min，至含水量24.6%，然后改用真空干燥，干燥温度30～35℃，干燥时间2h。

活细胞率的计算:称取5g未干燥的菌泥融入200mL的自来水中，通过平板计数法得到其总的活细胞数为N1(cfu/mL);将干燥后菌粉融入200mL的自来水中，然后37℃的水浴锅中复水活化0.5h，同样通过平板计数法得到其总的活细胞数N2(cfu/mL)。活细胞率(%)=N2/N1×100%。

1.2.2.3 微波真空干燥卡利比克毕赤酵母储藏期活性及生防效果的测定 每隔1个月称取一定量(约1g)的卡利比克毕赤酵母酵母干粉，将干燥后菌粉融入200mL的自来水中，然后37℃的水浴锅中复水活化0.5h，梯度稀释，用移液器取100μL涂平板，28℃下培养48h，菌落计数，计算每g卡利比克毕赤酵母干粉中的活菌数目。

用打孔器在桃子赤道的部位打1个直径3mm深3mm的伤口，每个桃子打2个伤口。按要求用移液器分别加入储藏后的复活的酵母干粉制剂(稀释到1×108cfu/mL)和新鲜酵母悬液(浓度1×108cfu/mL) 30μL，无菌蒸馏水作为对照组实验。常温下放置2h后，分别把30μL葡枝根霉孢子菌悬液(浓度为5×103个/mL)接种到伤口上。经过上述处理的桃子有序地放置在塑料筐里，并用保鲜膜进行密封，以保持筐内湿度。然后储存在25℃下，2d后测定果实发病率和病斑直径。每组实验用15个果实，实验重复3次。

表1 维生素C对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响Table 1 Thalli survival rate of Pichia caribbica liquid formulation with VC

表2 海藻糖对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响Table 2 Thalli survival rate of Pichia caribbica liquid formulation with trehalose

表3 卡利比克毕赤酵母对草莓葡枝根霉的抑制效果Table 3 Inhibition effect of Pichia caribbica on Rhizopus stolon

2 结果与分析

2.1 液体型制剂制备方法的研究

2.1.1 维生素C对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响 从表1可以看出，添加不同的维生素C的卡利比克毕赤酵母在保存后各组之间的细胞存活率差异不明显。但是不添加维生素C的细胞存活率明显低于处理组(P＜0.05)。

维生素C又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，酸性，具有较强的还原性。有报道表明天然抗氧化物质包括维生素C能通过一定程度抑制微生物的新陈代谢从而减缓微生物的生长［7］，这大概是维生素C能改善卡利比克毕赤酵母液体型制剂在保藏期间的细胞存活率的原因。

2.1.2 海藻糖对卡利比克毕赤酵母液体型制剂中菌体存活率的影响 从表2可以看出，添加2.5%海藻糖的卡利比克毕赤酵母的存活率达到82%，明显高于其他各组，其中没有添加海藻糖组的卡利比克毕赤酵母的存活率仅有31.28%。

海藻糖是一种非还原性二糖，广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂。海藻糖具有稳定生物膜结构和提高生物组织对逆境条件下的抗性［8］。因此，把海藻糖作为卡利比克毕赤酵母在液体型制剂中的保护剂，可减少酵母细胞在液体中保藏时受到外界不良因素的影响。其作用机理可能是:海藻糖不直接与细胞蛋白质结构相互作用，而是优先与水结合，使它们从蛋白质分子中的溶剂化层中排除出来，导致酶的溶剂化层半径减少，蛋白质的表观体积减小，可移动性降低，蛋白质分子结构更趋紧密，构象更稳定，从而抵御外界极端环境的影响。

2.1.3 储藏后卡利比克毕赤酵母液体型制剂的生防效果研究 从表3可以看出，保存后的卡利比克毕赤酵母和新鲜的卡利比克毕赤酵母都对草莓的葡枝根霉具有明显的抑制效果，而且两者没有明显的差异(P＞0.05)，说明了卡利比克毕赤酵母在保存过程中其生防效果没有受到影响。

从图1中可以看出，保存后的卡利比克毕赤酵母和新鲜的卡利比克毕赤酵母在20℃下培养能在草莓伤口处快速地生长。研究表明营养空间的竞争是拮抗酵母抑制致病霉菌的一种非常重要的方式［9］，因此，保存后的卡利比克毕赤酵母和新鲜的卡利比克毕赤酵母在草莓伤口处生长没有明显差异同样表明它们的生物防治效果没有明显差异(P＞0.05)。

图1 卡利比克毕赤酵母在草莓伤口处的生长动态Fig.1 The growth dynamic of Pichia caribbica in the cut of strawberry

2.2 固体型制剂制备方法研究

2.2.1 卡利比克毕赤酵母干粉制备 按照上述步骤实验，得到汇总结果见表4。

表4 利用微波真空炉制备卡利比克毕赤酵母活性干粉Table 4 Pichia caribbica active dry powder prepared by microwave vacuum furnace

综上实例所述，干燥所得产品的活细胞率随着水分含量的减少而降低，其影响因素，一方面是水分含量越低，干燥和复水过程中活性的损失就越大;另一方面，由于水分的大量减少，物料的介电损耗减少，吸收微波能也减少，不被水分吸收的微波能就会影响酵母的细胞膜及其核酸，从而影响细胞活性。由于本实验方法同时具用传热效率和干燥速率的优势，可以考虑将本方法与传统方法相结合，在保持传统方法高活性优势的同时，也能大大提高生产效率。

2.2.2 微波真空干燥卡利比克毕赤酵母储藏期活性

从图2中可以看出，通过对经过微波真空干燥的卡利比克毕赤酵母固体制剂保藏的研究表明，卡利比克毕赤酵母在3个月内的活性可以保持在储藏前的80%以上。卡利比克毕赤酵母干粉贮藏在4℃的条件下，可以在3个月内保持良好的生物活性。

图2 卡利比克毕赤酵母活性干酵母储藏期内的活性变化Fig.2 The activity of Pichia caribbica active dry powder during storage

2.2.3 卡利比克毕赤酵母活性干酵母储藏期后生防效果研究 从表5可以看出，卡利比克毕赤酵母固体制剂与新鲜制备组比较发病率及腐烂半径无显著差异(P＞0.05)，与对照组相比差异显著。对于桃子采后根霉病的腐烂发病率的影响显著低于对照组的发病率，都具有良好的生防效果。

表5 微波真空干燥卡利比克毕赤酵母储藏期后对桃子葡枝根霉的抑制效果Table 5 Inhibition effect of Pichia caribbica active dry powder on Rhizopus stolon in peach after storage

3 结论

酵母活细胞制剂加工工艺对微生物制剂产品的寿命、使用后的生长和生存能力、操作和应用的简便性以及成本等都有重要影响。与其他微生物制剂相比，应用于防治水果采后病害的微生物剂型研究相对滞后。

拮抗菌的商业化能否成功很大程度取决于拮抗菌产品的货架期以及拮抗菌产品是否保持生防效果。我们的实验结论显示，利用磷酸缓冲溶液添加0.01%维生素C和2.5%海藻糖作为保护剂制备的卡利比克毕赤酵母液体制剂和利用微波真空干燥技术(真空度8kPa，功率先为200W，后为100W，然后再进行真空干燥)制备的活性干酵母均能在货架期内保持高活率以及生防效果。说明液体制剂和固体制剂都可以作为卡利比克毕赤酵母活细胞制剂的商业化产品的形式。微波真空干燥技术应用于酵母活细胞制剂的制备对于提高生产率和降低能耗具有重要意义。

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Study on the processing of active cells agents of Pichia caribbica

PANG Shui-xiu，ZHANG Hong-yin*，YANG Qi-ya，ZHAO Li-na
(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)

The processing of active cells agents of Pichia caribbica in liquid and solid formulation was investigated. When 0.01%L-ascorbic acid and 2.5%trehalose were used as protectants，Pichia caribbica maintained high vibility of 81.8%after 15d at 20℃.When using microwave vacuum drying，with the vacuum 8kPa，and the power of 200W followed by 100W，Pichia caribbica in solid formulation with high viability of 100%and 9.4%water content was produced.And Pichia caribbica in solid formulation maintained high viability of 84.8%after 3 months at 4℃. Biocontrol efficiencies of Pichia caribbica in liquid and solid formulation were maintained after storage.

biocontrol;Pichia caribbica;liquid formulation;solid formulation;microwave vacuum drying

Q815

B

1002-0306(2012)02-0303-04

2011-03-30 *通讯联系人

庞水秀(1984-)，男，硕士研究生，研究方向:食品微生物学。

江苏省自然科学基金(BK2009214);江苏高校优势学科建设工程。