环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析

翟晓红,陈振明

(杭州师范大学生物催化研究室，浙江 杭州 311121)

环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析

翟晓红,陈振明

(杭州师范大学生物催化研究室，浙江 杭州 311121)

为研究鞘氨醇杆菌中环己酮单加氧酶的催化特性，从N.aromaticivoransDSM 12444基因组DNA克隆表达了一个编码环己酮单加氧酶的基因chmo，并分析了该基因产物的酶学性质.该基因全长1650bp，编码550个氨基酸，理论分子量为61.6 kDa.将携带此基因的重组质粒 pET28a-chmo转入E.coliBL21(DE3)后，获得了62 kDa 左右的表达产物.重组环己酮单加氧酶(CHMO)能氧化芳香族硫醚及其衍生物、链式硫醚、其他硫醚和酮类等底物，以2-氯乙基苯基硫醚为底物时活力最高(25.65 U/mg).CHMO最适反应温度和 pH分别为55 ℃和 8.87，倾向于利用 NADPH作辅酶.上述结果表明，重组CHMO是一个新型的环己酮单加氧酶，推测其与硫醚及酮类物质的氧化降解有关.

环己酮单加氧酶；鞘氨醇杆菌；优化表达；酶学性质

Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMOs)家族属于黄素类单加氧酶，通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮，生成相应的酯或内酯，也能催化硫、氮和磷的亲电氧化反应, 同时BVMOs还能催化酮和硼的亲核氧化反应[1].环己酮单加氧酶不仅可以提供极有价值的手性砌块，而且在手性药物的合成方面也具有很大的应用潜力.如它可以将极为廉价的非手性药物中间体双环[3,2,0]-2-双键-6-酮，加氧转化为极为昂贵的手性酯，生成物与反应物的市场价格相差近1000倍[2].它还可以催化含硫原子的手性前体生成光学活性的手性药物如莫达非尼和质子泵抑制剂奥美拉唑等[3-4].不是所有该家族的酶都能够外源表达[5]，自20世纪80年代第一个BVMO家族的环己酮单加氧酶(CHMOAci)的基因被克隆[6]至今，通过Genome-mining 等方法已经获得20余种该类酶.已有几种 CHMOs 得到了商业利用,但是还存在不足:产量很低,酶不稳定等很多问题[7].更多有价值的BVMO和基因工程菌尚有待发现.

为了获得高活力的BVMO，该研究从鞘氨醇杆菌N.aromaticivoransDSM 12444基因组中扩增出环己酮单加氧酶基因chmo，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了功能性表达，对其酶学性质进行了研究，并探讨了重组CHMO在硫氧化反应合成手性亚砜方面的应用潜力.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

N.aromaticivoransDSM 12444购自JCM，质粒pET-28a实验室保藏.

1.1.2 主要试剂和仪器

限制性内切酶购自NEB公司，Phusion DNA聚合酶购自Finnzymes公司，质粒纯化试剂盒、核酸纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Promega，基因组提取试剂盒购自天根.

PCR仪(美国ABI，veriti)，凝胶成像仪(Biorad-jeldoc)，蛋白电泳仪(天能，VE-180)，恒温培养振荡器(上海精宏，HZP-150)；超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-2FD).

1.1.3 培养基

PYG培养基(g/L)-蛋白胨：10.0，酵母提取物：5.0，葡萄糖：1.0，pH6.8-7.0,121 ℃高压灭菌20 min.LB培养基(g/L)-蛋白胨：10.0，酵母提取物：5.0，NaCl：10.0，pH7.0, 121 ℃高压灭菌20 min.

1.2 CHMO基因的克隆和表达

1.2.1 鞘氨醇杆菌(N. aromaticivorans DSM 12444)的培养

菌体接入灭过菌的PYG培养基，30 ℃恒温振荡培养.

1.2.2 基因组DNA的提取

参照细菌基因组提取试剂盒(天根).

1.2.3 CHMO基因的PCR扩增条件

根据NCBI数据库注册的环己酮单加氧酶基因序列设计引物，以N.aromaticivorans基因组DNA为模板扩增环己酮单加氧酶CHMO(YP_496757)基因.引物如下，PF：(CATATGGAAGCAGCAGCCGGT)，PR：(CTCGAGTCAGGCCATTTCGAAGCCTTCGT).98 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，63.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，然后加Taq 72 ℃延伸20 min，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.2.4 TA克隆

CHMO基因的纯化参照Promega琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒相关操作，纯化后CHMO基因构建至pGEM-T Easy，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆.

阳性克隆参照Promega质粒小提试剂盒提取质粒，PCR验证.南京金斯瑞公司测序.

1.2.5 表达载体构建

双酶切测序正确的pGEM-T-chmo，分离回收后的目的基因构建至pET-28a(+)，获得pET-28a(+)-chmo表达载体，将此表达载体转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，获得目的基因工程菌.

1.2.6 目的蛋白表达、诱导条件优化

将工程菌接于5 mL LB(含50 μg/mL Kan)中，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜然后将菌液按1∶100比例转接于装有100 mL LB培养基(含50 μg/mL Kan)三角瓶中，继续进行菌体培养，当OD600nm 到0.6～0.8时，加入0.1 mmol/L IPTG，18 ℃、150 rpm振荡培养18 h，离心收菌， SDS-PAGE(浓缩胶5%，分离胶12%)分析目标产物表达情况.

进一步表达条件优化以OD600nm约为0.6～0.8时，不同温度(15 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃)、不同摇床转速(110 r/min、150 r/min、170 r/min、200 r/min)及向培养物中加入不同终浓度的IPTG，进行诱导培养，通过SDS-PAGE分析考察诱导培养条件对目的基因表达的影响.

1.3 CHMO的酶学性质及同源建模

1.3.1 CHMO蛋白纯化及酶活力

采用Ni+柱亲和层析一步法纯化蛋白CHMO，操作步骤参照 Ni SepharoseTM6 Fast Flow试剂盒的使用指南.

还原型辅酶NADPH在340 nm处有明显吸收，而氧化型NADP+无吸收.CHMO在氧化硫化物生成光学亚砜的过程中会消耗NADPH生成NADP+，引起吸光值降低.酶活力测定体系为：Tris-HCl(50 mM，pH 8.87) 2.86 mL；NADPH 0.40 μmol；茴香硫醚0.6 μmol；蛋白0.4 mg.酶活力单位定义为：在室温25 ℃下，每分钟消耗1 μmol NADPH的酶量定义为1个酶活力单位(U).

1.3.2 CHMO辅酶依赖性

分光光度法检测相同条件下CHMO以NADH和NADPH分别作辅酶时的活性，判断辅酶依赖型.

1.3.3 温度和pH对CHMO酶活力的影响

测定不同温度(25 ℃～75 ℃)下酶催化氧化茴香硫醚的活力以确定最适温度.

采用50 mM Tris-HCl(pH 7.42～8.87)和50 mM 甘氨酸-NaOH(pH 8.87～9.65)，检测不同pH值对硫氧化酶氧化茴香硫醚活力的影响，确定最适pH.

每组设3组平行实验.

1.3.4 CHMO的底物特异性

测定纯化后的CHMO对20种不同底物(见表1)的反应活性，确定CHMO的底物广谱性.

1.3.5 三维结构分析及蛋白的同源建模

搜索瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的Swiss pro Modeling 建模服务器,通过提交的序列信息在蛋白质结构库中搜寻模板,在Swiss-pdb viewer 中通过人工方法对局部结构进行调整,采用蛋白质三维图像软件Swiss-Pdb Viewer 打开并分析作图.

表1 CHMO的底物特异性Tab. 1 The substrate specificity of CHMO

2 结果与分析

2.1 CHMO基因的克隆

以抽提的N.aromaticivoransDSM 12444基因组为模板，利用引物PF和PR进行PCR，扩增出环己酮单加氧酶编码基因chmo，经测序该基因长为1650 bp(见图1)，编码550个氨基酸，理论计算分子量为61.6 kDa.

2.2 表达载体pET-28a(+)-chmo的构建

获得环己酮单加氧酶基因后，将其连接到pGEM-T Easy上，得到pGEM-T-chmo重组质粒送去测序，将测序正确的环己酮单加氧酶基因连接到pET-28a(+)(NdeⅠ和XhoⅠ双酶切)上，得到pET-28a(+)-chmo重组质粒. 以上述两个限制性内切酶双酶切重组质粒，得到大小为1600 kb左右的片段(见图2)，证明环己酮单加氧酶基因已插入到pET-28a(+)载体中，成功构建了pET-28a(+)-chmo表达载体.将重组质粒pET-28a(+)-chmo转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌.

图1 PCR 产物Fig. 1 Production of PCR

图2 pET-28a-chmo双酶切结果Fig. 2 Plasmid digested of PCR by NdeⅠand XhoⅠ

M: marker; 1:诱导后全菌液；2：破碎后上清；3：Ni柱纯化后蛋白图3 表达产物及纯化后SDS-PAGE电泳检测结果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the soluble proteins and purified enzyme

2.3 重组CHMO的表达与纯化

通过IPTG浓度、温度、摇床转速等产酶因素优化，得到最佳培养条件为：37 ℃培养至 OD600为0.6～0.8时，添加0.4 mmol/L IPTG，15 ℃，110 rpm诱导 14 h.对重组菌进行超声波破碎并离心分离，Ni柱纯化.重组酶纯化后的比活力为3.75 U/mg(为纯化前的1.17倍)， 蛋白大部分出现在上清液中，表明经过表达条件优化该重组酶在水溶液中具有较好的溶解度.重组蛋白大小在60 KDa左右，符合预期.

利用重组质粒携带的组氨酸标签，表达的重组酶经Ni2+亲和色谱纯化后SDS-PAGE 检测，显示为单一条带(图 3)，实现了重组蛋白的一步纯化.

2.4 酶学性质检测结果

2.4.1 CHMO辅酶依赖性

用NADPH作辅因子测定CHMO的比活力为3.75 U/mg，是用NADH作辅因子时的4倍左右，所以CHMO更倾向于用NADPH作辅因子.

2.4.2 温度和pH对CHMO酶活力的影响

测定不同温度下重组 CHMO的酶反应初速度，研究温度对酶活力的影响.结果如图 4a 所示，当氧化茴香硫醚(PMS)时，酶活力在55 ℃达到最大值，然后随着温度的升高而降低.高温对重组酶的活力影响很明显，65 ℃时相对酶活力仅有57%.

图4a 温度对CHMO催化活性的影响Fig.4a Effect of temperature on activity of CHMO

图4b pH对CHMO催化活性的影响Fig.4b Effect of pH on activity of CHMO

在最适温度下，采用不同pH值的缓冲体系，分别测定酶反应初速度，确定重组CHMO的最适pH值.当以PMS为底物时， pH值为8.87时酶活力最大， pH适应范围较窄(图 4b).

2.4.3 CHMO的底物特异性

选PMS作为标准底物，活力为(3.75 U/mg)，测定其他20种底物的相对活性(表 1).由表中数据可知，CHMO几乎对所有的芳香族硫醚及其衍生物都具有较高的活性，但是对直链的硫醚活性普遍较低，对甲基硫环己酯和1,3,-二噻烷的活性也很高，可以考虑作为催化合成各种手性亚砜的催化剂.

2.5 同源建模

Blast分析表明CHMO的基因与醋酸钙不动杆菌的环己酮单加氧酶(GenBank Accession No. BAA86293.1)具有同源性，氨基酸相似性为41.3%.预测该片段的氨基酸序列,并进行氨基酸同源性对比时发现该片段与单加氧酶家族诸多成员具有较高的同源性,并且包含两个“GXGXXG”序列(可成为FAD和BVMO的非共价结合位点)和一个BVMO家族的特征性指纹“F(Y)XGXXXHXXXW”[8].第一个氨基酸发生了变异但是仍然同属于芳香族氨基酸，仍然可以判定CHMO为BVMO家族[9].通过SWISS-MODEL同源建模服务器对其进行3D结构模拟分析，发现该酶具有经典的BVMO三维结构和FAD的结合域(图5).

图5 重组环己酮单加氧酶的3D结构模拟Fig. 5 Structural modelling of recombinant CHMO from N. aromaticivorans

3 讨 论

鞘氨醇杆菌中含有8个BVMO编码基因，是筛选和研究BVMO的一个良好酶源[5].通过基因克隆在大肠杆菌中实现高效表达，并利用His-tag作为纯化标签纯化重组酶，是一个较为高效的研究BVMO的策略.但是外源表达时重组蛋白常以包涵体形式存在，根据文献[10]外源基因以包涵体形式表达是因为外源基因在大肠杆菌中表达过快，没有得到正确折叠，其能否以可溶形式表达不仅取决于基因、载体和宿主三者之间的相互关系，而且受到诱导物的浓度、诱导温度等条件的影响.本文中通过优化CHMO的诱导表达条件在低温(15 ℃)诱导下获得了CHMO的可溶性高效外源表达.

本实验中，将携带CHMO基因的重组质粒 pET28a-chmo转入E.coliBL21(DE3)后，获得了62 kDa 左右的表达产物，与预期相符.使用Ni柱纯化后测定其最适反应温度为55 ℃与热稳定的PAMO[11]相似.与其他BVMO[12]不同的是CHMO对酮类底物活性普遍偏低对硫化物的活性较高，尤其是以2-氯乙基苯基硫醚为底物时活力最高(25.65 U/mg).重组CHMO作为一种新型的生物催化剂，推测其主要与硫化物的代谢有关.

随着手性化学合成中手性砌块需求的不断增加，“环境友好、能耗低、排放少”的手性生物合成技术中的生物催化剂——酶的研究开发显得越来越重要[13-16]，一方面是寻找新的酶种，另一方面对已有酶进行分子改造，提高其性能.通过实验测定了CHMO的一些酶学基本性质，为进一步探索CHMO的热稳定性、离子浓度和有机试剂对酶活性的影响及对酶的对映体选择性的影响以及结构改造等打下基础，相关研究工作正在进行中.

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CloningExpressionandEnzymeCharacterizationofaCyclohexanoneMonooxygenase

ZHAI Xiao-hong, CHEN Zhen-ming

(Lab of Biocatalysis, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China)

To explore the biocatalytic properties of cyclohexanone monooxygenase(CHMO) inN.aromaticivorans, the experiment cloned the genechmofromN.aromaticivoransDSM 12444, and analyzed the enzyme characterization of its products. The length of the genechmowas 1650bp encoding a CHMO with 550 amino acid residues and calculated molecular mass of 61.6 kDa. The recombinant plasmid pET-28a-chmowas constructed and functionally expressed inE.coliBL21 (DE3), resulting in the products with the size of 62 kDa. The recombinant CHMO could oxidize aromatic sulfide and its derivatives, chain sulfide as well as other sulfide and ketone substrates. The enzyme showed the highest activity against 2-chloro ethyl phenyl sulfide, withVmaxof 25.65 U/mg. The optimal temperature was 55 °C and optimal pH was 8.87, NADPH was inclined to be the coenzyme. These results indicate that the recombinant CHMO was a novel CHMO and might play a role in the oxidative degradation of sulfide and ketones.

cyclohexanone monooxygenase;N.aromaticivorans; optimized expression; enzyme characterization

2012-04-03

陈振明(1971—)，男，副教授，主要从事生物催化和绿色化学研究.E-mail： zmchen05@gmail.com

11.3969/j.issn.1674-232X.2012.05.003

Q814.9

A

1674-232X(2012)05-0397-06