100例江西地区健康汉族人群ABO血型基因分型的研究

毛征宇，万本愿，王文丁，陈 会，徐红萍

(1、江西省人民医院输血科，江西 南昌 330006；2、江西省临床检验中心，江西 南昌 330006；3、江西省人民医院检验科，江西 南昌 330006)

准确鉴定血型是保证临床输血安全、防止重大医疗事故发生的重要保证。常规应用的ABO血型血清学正反定型技术，具有简单实用的特点，但亦存在一定的局限性，而基因分型的方法在某种程度上克服了血清学实验的弱点，可以作为血清学方法的有益补充。本研究采用血清学和PCRSSP法两种方法对比鉴定ABO血型，旨在江西地区临床输血工作中，建立起稳定的PCR-SSP基因分型方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2006年10月至2011年10月，随机选取江西地区健康汉族无关个体100例，年龄18～55岁。抽取静脉血3ml并EDTA抗凝。

1.2 试剂抗A、抗B血型定型试剂(北京金豪制药股份有限公司)，AC、BC、OC及正反定型微柱凝胶卡(长春博讯生物技术有限责任公司)，ABO基因分型试剂盒(美国G&T公司)，基因组DNA提取试剂盒、Taq酶和 Marker(TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 DNA提取严格按TaKaRa公司试剂盒说明书的要求进行操作。抽提完成后，取10μl DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察结果，并使用紫外分光光度计测定其OD值然后计算浓度(UV752N型紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司)，DNA终浓度调节至40～70ng/μl。

1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系的总体积为9μl，包含1μl DNA样品，1μl Taq酶 (预先经 15倍稀释，0.33-0.5U)，基本引物 Mix-A、Mix-A201、Mix-B和Mix-O的混合液7μl。PCR扩增条件(1000-Series Thermal Cyclers型PCR仪，美国Bio-rad公司)：预变性 95℃ 5min→变性 95℃ 30s→退火 60℃30s→延伸72℃ 90s(30个循环)→终末延伸72℃5min→保温4℃。

1.3.3 PCR产物的电泳分析 PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分析，以100V电压电泳25min后紫外灯下观察条带，扩增条带与内对照207bp(人生长激素基因，hGH)及DL 500 DNA Marker相比较并读取结果，凝胶成像系统中拍照记录(Uvipro型凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司)。

1.3.4 结果判断 根据是否产生特异性目的片段以及片段的长度大小来确定基因分型，判读标准和基因分型格局如表1、表2所示。

1.3.5 血清学分型方法 正反定型凝胶微柱法和盐水凝集试管法，操作过程和判读标准参照文献[1]。

2 结果

2.1 血清学分型结果 采用ABO血型凝胶微柱卡和盐水凝集试管法对100例江西地区健康汉族无关个体进行血清学分型，检测出A型32例(32.0%)，B 型 24 例(24.0%)，AB 型 8 例(8.0%)，O 型36例 (36.0%)。计算其基因频率可知：A基因为0.2253，B 基因为 0.1753，O 基因为 0.5998。

表1 ABO基因分型的判读参数

表2 基因分型的电泳格局

2.2 PCR-SSP法基因分型结果 采用PCR-SSP法进行基因分型，共检出4种等位基因(即A、B、O和A201)9种基因型：A/O 型14例(14.0%)，A/A201型11例 (10.0%)，A201/O 型 6例 (6.0%)，A/A 型 1 例(1.0%)，B/O 型 17 例(17.0%)，B/B 型 7 例(7.0%)，A/B 型 5例(5.0%)，A201/B 型 3例(3.0%)，O/O 型 36例(36.0%)。基因分型结果与血清学分型结果一致。

3 讨论

ABO血型基因分型技术在国内外进展迅速，甚至有国外学者撰文探讨对于具有百年历史的凝集试验是否该说“再见”[2]。我们采用血清学和基因分型两种方法对100名江西健康汉族个体进行血型鉴定，结果显示：血清学分型与基因分型结果一致，江西地区人群以O型为多，基因频率的分布：A基因为0.2253，B基因为0.1753，O基因为0.5998，这与我国汉族人群的分布情况基本吻合，同时也符合ABO血型在中国分布特点的推断[3]：从北向南方向，B基因频率逐渐下降，而O基因频率升高，云、贵、川和长江中下游地区A基因频率升高。

随着输血学和组织、器官移植技术的研究发展，传统血清学方法的若干不足也逐渐暴露出来[4]。对于亚型和变异型、特殊疾病导致的抗原表达异常(白血病、肿瘤等)[5]、细菌污染或血浆蛋白紊乱导致的弱凝集或假凝集、不规则抗体和自身抗体等情况的分辨率不高，往往需要进行抗人球蛋白试验、吸收放散实验、唾液物质鉴定等额外的验证性实验；结果判读的主观性较大，不同实验室甚至不同实验人员之间的结果可比性不强；试剂的质量对于鉴定结果有决定性影响等[6，7]。然而运用基因分型技术进行ABO血型鉴定，克服了血清学方法易受抗原活性竟争、抗体的特异性及微生物污染等因素的影响的缺点，不需要做繁杂的一系列血清学实验，并且，正反定型、吸收放散实验、盐水凝集试管法、抗人球蛋白实验等血清学方法只能鉴定表型，而基因分型技术则可以直接确定ABO血型基因型，有效的解决了疑难血型鉴定难的问题，所以说，基因分型技术不但可以补充血清学方法的不足，对于疑难血型的正确诊断也有重要作用，对临床输血医学水平的提高有很大的意义[8]。

[1]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006,246-256.

[2]赵桐茂,人类血型分型的新纪元[J].中国输血杂志,2007,20(1):1-2.

[3]陈稚勇,赵桐茂,张工梁.中国人ABO血型分布[J].遗传,1982,4(2):4-7.

[4]周炳能.29例ABO血型正反定型不一致原因探讨[J].实验与检验医学,2010,28(2):189-190.

[5]吴敏华,陈活强,蔡葵.恶性血液病引起ABO血型鉴定困难的探讨[J].实验与检验医学,2008,26(6):690-692.

[6]严建新,陈敏霞.浙江沿海地区汉族人A型及AB型血型的基因亚型研究[J].中国卫生检验杂志,2010,20(2):341-344.

[7]雷国华,钟清兰,熊永萍,等.微柱凝胶免疫检测法在配血及血型鉴定中的应用[J].实验与检验医学,2010,28(2):202-204.

[8]黄新宝,鞠海英.基因分型在正反定型不符病例中的诊断意义[J].中国实验诊断学,2011,15(7):1211-1212.