牛耳枫生物碱F21对HepG-2细胞的抑制作用及机制

曹志然，王永丽，戎瑞雪，王 蓓，王 海

(河北大学基础医学院免疫学系，河北保定 071000)

牛耳枫(Daphniphyllum calycinum Benth)是交让木科(Daphniphyllaceae)交让木属(Daphniphyllum)植物，以根、叶入药，其味苦涩，其功效为清热解毒，活血舒筋。牛耳枫的叶和种子中均含有生物碱，且结构复杂、形式多变，目前有关牛耳枫生物碱药理作用的研究主要集中在抗胆碱酯酶活性及杀虫作用方面，而对于其在抗肿瘤方面的研究报道甚少［1-2］。本课题组采用各种色谱方法从牛耳枫茎叶乙醇浸提物中分离提取到12种生物碱，采用MTT体外抗肿瘤活性的筛选发现生物碱F21在体外对人肝癌细胞株(HepG-2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人肺腺癌细胞(A549)、人神经胶质瘤细胞(U-251)和人乳腺癌细胞株(MCF-7)等均具有一定的抑制作用，其中对HepG-2的抑制作用最强。通过波谱技术及理化性质鉴定 F21化学结构与 deoxycalyciphylline B相似［3］。本研究选择最敏感的HepG-2作为研究对象，通过肿瘤细胞的形态学变化、琼脂糖凝胶DNA电泳分析、膜联蛋白(Annexin)Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染流式细胞术以及胱天蛋白酶抑制剂阻断实验等手段研究F21抗HepG-2的作用及作用机制，为该化合物的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂及仪器

F21是从牛耳枫的茎叶乙醇浸提物中采用正相硅胶，反相材料(C18，MCI)以及凝胶(Sephadex LH-20，Toyopearl HW-40C)分离得到，获取率为1.6 mg·kg-1，并运用薄层色谱及层析法纯化，其纯度为99%;HepG-2细胞株购自中国科学院药物研究所;RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;1∶250胰蛋白酶购自北京Solarbio公司;磷酸盐缓冲液PBS购自北京金杉金桥生物技术有限公司;噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司;二甲亚砜(DMSO)购自北京Solarbio公司;瑞姬氏染料购自美国Amresco公司;细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒、DNA标志物(BeyoRed)、胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK和星形孢菌素(staurosporine，STS)均购自碧云天生物技术研究所;PI购自美国Sigma公司。

洁净工作台(SW-CJ-2FD)，苏州安泰空气技术有限公司;二氧化碳培养箱(HF90)，上海力申科学仪器有限公司;倒置显微镜(CKX41SF)，日本Olympus Corporation;ELX-800全自动酶标仪(ELISA Reader)，美国宝特有限公司;台式高速离心机，美国Sigma公司;DYY-11B电泳仪，北京市六一仪器厂;流式细胞仪，美国BD FACScalibur;HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2 细胞培养

RPMI 1640完全培养液(含10%热灭活胎牛血清、0.2%NaHCO3、青霉素 100 kU·L-1、链霉素100 mg·L-1)，在 37℃、饱和湿度、5%CO2的环境下培养HepG-2细胞，当细胞融合达到70% ～80%时，用胰酶2.5 g·L-1消化成单个细胞接种传代。取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 MTT法检测HepG-2细胞存活率

取对数生长期的HepG-2细胞，制备2×107L-1单细胞悬液，以每孔90μl接种于96孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h，细胞贴壁后按照分组分别加入10μl待测样品，F21终浓度分别为100，50，25，12.5 和 6.25 mg·L-1;溶剂对照组每孔加10μl与待测样品相应浓度DMSO的培养液，各组均设3个复孔，每块板均设3个空白对照孔(仅加培养液，无细胞)。置培养箱中继续培养，分别于20，44和 68 h取出培养板，每孔加 10μl MTT 10 g·L-1，4 h 后终止培养，弃上清，加 DMSO 100 μl振荡5 min待结晶物充分溶解后，在490 nm波长下测定各孔吸光度值(absorbance，A)，计算肿瘤细胞增殖抑制率(IR)，IR(%)=(1-A药物/A溶剂对照) ×100%。改良寇氏法计算半数抑制浓度［4］。

另按每孔8×103个HepG-2细胞接种于96孔板，37℃培养24 h细胞贴壁后进行实验。设正常对照组、STS50 mol·L-1组、STS+Z-VAD-FMK 组、F21 10 mg·L-1组、F21 10 mg·L-1+Z-VAD-FMK 20 μmol·L-1组、F21 30 mg·L-1组及 F21 30 mg·L-1+Z-VAD-FMK 20 μmol·L-1组，作用 48 h。每个组均设3个复孔，MTT法测定细胞增殖能力并计算各组细胞的增殖抑制率。实验重复3次。

1.4 瑞姬氏染色观察细胞形态

取对数生长期的HepG-2细胞，调整细胞密度为1×108L-1，接种于盖玻片上;37℃恒温恒湿、5%CO2的培养箱中孵育24 h后，F21组换以含终浓度为10，30和100 mg·L-1的 RPMI 1640培养液，正常对照组加入等体积 RPMI 1640完全培养液，分别继续培养48 h;瑞姬氏染色并于光镜下观察。

1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳

分别取l×106个对数生长期的HepG-2细胞接种于100 ml培养瓶中，置于37℃恒温恒湿、5%CO2的培养箱孵育24 h;弃上清液，按照分组分别加入含F21 10，30和100 mg·L-1的RPMI 1640培养液，正常对照组加等体积RPMI 1640培养液，继续培养48 h;细胞收集后按试剂盒说明进行DNA抽提和电泳。

1.6 流式细胞仪检测HepG-2细胞凋亡率

取对数生长期的HepG-2细胞，调整细胞密度为2×108L-1，置于37℃恒温恒湿、5%CO2的培养箱孵育24 h;按照分组分别加入含 F21 10，30和100 mg·L-1的RPMI 1640培养液，正常对照组只加入RPMI 1640培养液，继续培养48 h，收集细胞、PBS缓冲液洗涤后，FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪检测。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 F21对HepG-2细胞存活的影响

表1结果显示，F21对人肿瘤细胞HepG-2有显著的抑制作用，且其抑制作用具有较好的时效(F=65.59，P ＜0.05)和量效(F=232.39，P ＜ 0.05)关系，在 24，48 和 72 h 的 IC50值分别为 5.3 ±0.1，1.3 ±0.1和(0.13 ±0.1)mg·L-1。

Tab.1 Effect of F21 on HepG-2 cell porliferation

2.2 F21对HepG-2细胞形态的影响

正常对照组细胞膜完整，胞浆呈蓝色，胞质均匀，细胞核完整，染成紫红色，核仁明显(图1A)。F21 10 mg·L-1处理48 h后，表现为细胞体积增大，胞质内细胞核周围出现大量空泡，且密度降低，但细胞膜及细胞核保持完整(图1B)。F21 30 mg·L-1处理后，细胞膜完整性破坏，胞浆内有空泡形成，细胞核破碎，且密度降低(图1C)。F21 100 mg·L-1处理后细胞破坏严重，细胞形态消失(图1D)。

Fig.1 Effect of F21 on HepG-2 cell morphology(Wright-Giemsa ×20).A:normal control group;B:F21 10 mg·L-1 group;C:F21 30 mg·L-1 group;D:F21 100 mg·L-1 group.Arrow shows typical morphological changes.

2.3 F21对HepG-2细胞凋亡的影响

2.3.1 DNA 琼脂糖凝胶电泳

如图2所见，正常对照组未见明显的DNA降解片段，F21 10，30 和 100 mg·L-1处理 HepG-2 细胞48 h后，均未见特征性的DNA梯状条带。

Fig.2 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by agarose gel electrophoresis.Lane 1:DNA ladder marker;lane 2:normal control group;lane 3:F21 10 mg· L-1 group;lane 4:F21 30 mg·L-1 group;lane 5:F21 100 mg·L-1 group.

2.3.2 流式细胞术

图3 结果显示，F21 10，30 和100 mg·L-1处理细胞48 h后，HepG-2细胞晚期凋亡率分别为(17.34±0.01)%，(25.45 ±0.01)% 和(43.67 ±0.03)%，与正常对照组比较，均有显著差异(P＜0.05)，且随浓度增加，其凋亡率也增加(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of F21 on HepG-2 cell apoptosis by flow cytometry.A:normal control group;B:F21 10 mg·L-1 group;C:F21 30 mg·L-1 group;D:F21 100 mg·L-1 group.

2.4 Z-VAD-MFK对F21抑瘤活性的影响

表2结果显示，与正常对照相比，单独F21 10和 30 mg·L-1及 STS 50 mol·L-1处理 12 h 后，细胞活力明显降低(P＜0.05)，F21+Z-VAD-FMK联用组细胞存活率也明显降低(P＜0.05);与单用F21细胞相比，F21+Z-VAD-FMK组细胞存活率无显著差异;与单用STS组相比，F21+Z-VAD-FMK组细胞存活率增加(P＜0.05)。此结果表明F21对HepG-2细胞杀伤不被胱天蛋白酶抑制剂阻断，即其杀伤肿瘤细胞的作用机制并非与胱天蛋白酶激活通路有关。

Tab.2 Effect of Z-VAD-FMK on proliferation of Hep G-2 cells

3 讨论

自第一个植物来源的生物碱类抗肿瘤药长春碱1960年8月在美国上市以来，生物碱类抗肿瘤药的发展十分迅速。特别是紫杉醇和喜树碱的出现，成为抗肿瘤药具有划时代意义的药物。研究表明生物碱抗肿瘤作用主要通过:① 作用于细胞微管，抑制其解聚或聚合;②抑制拓扑异构酶Ⅰ活性;③ 诱导细胞凋亡;④诱导肿瘤细胞分化和抑制肿瘤细胞增殖;⑤ 作用于细胞膜等［5-6］。

本研究结果表明牛耳枫生物碱F21可明显抑制HepG-2细胞的增殖，且有明显的时效和量效关系，形态学实验结果表明，F21可使细胞出现明显的形态学变化，随着剂量的增加细胞膜完整性开始遭到破坏，最终致细胞核破碎，且伴随着整个细胞的密度大幅降低，表明F21可通过引起细胞死亡而发挥抗肿瘤作用。

一般认为细胞死亡的方式主要有细胞坏死和细胞凋亡［7］，最新研究发现一种新的非凋亡性程序性死亡称为 paraptosis［8］。Paraptosis在形态学上与凋亡不同，不具有凋亡的典型特征，即缺少染色质的新月形凝集和凋亡小体。它是以胞浆空泡的形成为特征，在整个过程中胞浆和胞核密度增加，线粒体肿胀，但细胞膜和细胞器仍保持完整;无阶梯状DNA梯带;paraptosis过程为胱天蛋白酶非依赖性的，而细胞凋亡典型的形态学变化为核固缩，有凋亡小体形成，DNA出现阶梯带变化，细胞凋亡过程为胱天蛋白酶依赖性［10-12］。本研究结果显示小剂量的F21(10 mg·L-1)引起的细胞死亡从形态上看既不同于细胞坏死又不同于细胞凋亡，而类似于paraptosis。

本研究的琼脂糖凝胶电泳中没有出现典型的凋亡梯带。3次重复试验结果发现不同剂量F21作用后出现了不同的DNA梯带，关于造成此实验结果的机制有待于进一步研究。流式细胞仪检测显示F21可诱导HepG-2细胞死亡，且随浓度增加，其死亡率也增加。实验结果未出现明显的早期凋亡，表明F21诱导HepG-2细胞死亡方式不同于典型的细胞凋亡。此外，凋亡抑制试验表明F21诱导的细胞死亡不被胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK所抑制，即F21诱导的细胞死亡没有发生胱天蛋白酶的活化。

综上所述，根据形态学观察以及各种凋亡检测方法的进一步分析表明，F21可能通过类似于paraptosis的方式引起HepG-2细胞的死亡并发挥抗肿瘤作用，有可能发展成一种新的抗肿瘤药物，其确切作用机制尚待进一步研究。

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