丹参注射液联合骨髓干细胞移植治疗脑梗死肢体瘫痪的临床研究

邓英光，张紫萍，余 卫

脑梗死是常见病、多发病，提高患者生活质量已成为医学研究的重要课题。近年来随着骨髓干细胞 (MSC)生物学研究的不断深入，发现某些MSC不但能再生其特定细胞，而且在一定环境下可转变生成其他组织系统的细胞，这是20世纪末MSC领域的突破性进展之一［1］。我院神经科从2008年9月开始，试用丹参联合自体MSC移植，通过新生血管重建动脉侧支循环和改善血流，修复缺血组织和损伤的神经，从而缓解瘫痪肢体症状，改善脑梗死肢体瘫痪患者的不良预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院神经内科30例脑梗死肢体瘫痪患者。病例纳入标准:(1)符合全国第四次脑血管会议制定的《脑血管疾病分类 (1995)》脑梗死的诊断标准［2］;(2)年龄18～80岁;(3)第1次患脑梗死发病3d内入院，治疗2～3周出院;(4)出院时无意识障碍，单侧或双侧肢体肌力＞Ⅰ级，＜Ⅳ级。排除标准:(1)药物过敏者;(2)有严重心、肝、肾等疾病者;(3)有严重精神障碍者;(4)难以随访者。

1.2 方法

1.2.1 分组 将30例脑梗死肢体瘫痪确诊患者 (包括初次确诊患者和已接受传统疗法治疗无效者)分为丹参治疗组 (对照组)15例，丹参配伍MSC治疗组 (治疗组)15例。

1.2.2 MSC体外培养 无菌条件局麻下骨穿抽取患者自体50ml新鲜骨髓液，PBS稀释1倍后，轻轻叠加到50ml Ficol分离液上，在常温下1500r/min，离心20min，分离出单核细胞，用加拿大Mesencult培养液重新悬浮细胞，调整细胞浓度为(1～5)×106/ml，接种于175cm2的细胞培养瓶中 (每瓶15ml)，放置于饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱中。3d后更换培养液，弃掉未贴壁的悬浮细胞，10d后传代，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化贴壁细胞，将细胞重新悬浮，按1∶2比例传代。4d后半量换一次液，7d后0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收获细胞。

1.2.3 MSC的鉴定 MSC的鉴定通过流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表达，MSC 的特点是，并同时监测细菌污染指标。

1.2.4 移植方案 采用静脉滴注作为移植途径，根据收获的细胞数量确定移植次数，每次为 (1～5)×107个细胞。MSC治疗组按1、3、5d 3次静脉输注MSC，输注前30～60min静脉滴注20%甘露醇250ml增强血脑脊液屏障的通透性。

1.2.5 临床治疗方案 对照组:丹参注射液10ml加入5%葡萄糖溶液250ml中，静脉滴注，1次/d，连续14d。治疗组在输注MSC前1d开始连续使用丹参注射液14d。

1.3 疗效评估

1.3.1 美国国立卫生研究院卒中 (NIHSS)量表［3］采用NIHSS评定患者神经功能缺损程度。临床疗效根据治疗前后NIHSS评分的变化及残障水平评定:(1)基本痊愈:NIHSS评分减少90%～100%，残障水平0级;(2)显著进步:NIHSS评分减少46% ～89%，残障水平l～3级;(3)进步:NIHSS评分减少18%～45%;(4)无变化:NIHSS评分减少或增加＜18%;(5)恶化:NIHSS评分增加≥18%;(6)死亡。

1.3.2 比较功能综合评定 (FCA)量表 每个项目满分6分，最低分1分。本研究选取其中5个观测内容 (自我照料、括约肌控制、转移、行走、上下楼梯)，即躯体功能评定，共分为13个项目观测内容，满分78分，最低分13分。

1.3.3 主要观察指标 以CT血管三维重建和彩色多普勒检查，观察动脉侧支循环和脑梗死区域血流重建情况;检查血、尿、便常规、肝、肾功能、心电图等，全面了解患者病情。

1.4 安全性评估 观察丹参注射液及MSC移植治疗期间的不良反应。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料以(±s)表示，组间比较采用t检验，两两比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NIHSS、FCA量表评分结果 两组治疗前与治疗后14d和治疗后28d NIHSS、FCA量表评分比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05);对照组治疗后14d和18d的NIHSS及FCA分别与治疗组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

2.2 客观评价标准 治疗1个月后脑血管造影CT三维重建和彩色多普勒检查示脑梗死区域有一定数量的新生侧支血管。

2.3 不良反应 治疗后患者无发热反应及其他不适感，血、尿、便常规、肝、肾功能、心电图等检查未见特殊改变。

表1 两组治疗前后NIHSS、FCA比较(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

表1 两组治疗前后NIHSS、FCA比较(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

注:与同组治疗前比较，*P＜0.05;与对照组比较，#P＜0.05

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3 讨论

近年来关于MSC的生物学研究表明，MSC具有多向分化潜能，其携带了人体全部基因组，可同时对骨骼肌、心肌和神经系统等受损组织进行修复［4］。MSC中的内皮祖细胞为促血管新生细胞，能分化为血管内皮细胞而诱导血管形成，使细胞移植治疗缺血性疾病的研究取得了突破性的进展［5］。Kalka等［6］试验证明，直接移植骨髓间充质干细胞 (BMSCs)可增强一些缺血性疾病的血管生长，在缺血局部可横向分化为血管内皮细胞，并进一步分化形成新生毛细血管，形成新的侧支，改善患者局部血供。而且Chen等［7］采用脑损伤组织匀浆进行体外MSC培养发现，在含有脑损伤组织匀浆的培养环境下，MSC能产生多种神经营养因子，包括神经生长因子 (NGF)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子 (VEGF)，为中枢神经系统移植MSC促进神经再生，改善中枢神经系统损伤后的生物学行为提供了分子生物学证据。

治疗组在脱水、调控血压、防止血小板聚集和改善脑供血等脑梗死肢体瘫痪常规治疗基础下，再用丹参注射液联合MSC移植治疗，结果显示，两组患者治疗后14d和28d时的NIHSS和FCA评分均有改善，且治疗组的评分均优于对照组(P＜0.05)，这说明丹参注射液联合MSC移植治疗对改善脑梗死肢体瘫痪患者的神经功能缺失，恢复患者的部分身体功能，使得患者恢复到患病前一定的日常生活能力。推测其机制可能包括:(1)丹参对于促进创伤修复再生、改善局部微循环、减轻组织缺血再灌注损伤等方面都具有较好作用。丹参多酚酸盐是丹参水溶性活性部位，其能够促进单核细胞合成和分泌VEGF、bFGF，进而促进内皮细胞的迁移，推测丹参多酚酸盐促进内皮细胞迁移可能是促血管生成的机制之一［8］。 (2)MSC的神经细胞分化潜能可产生某种程度的神经再生，修复梗死脑组织［9］，而且MSC具有透过血脑脊液屏障和向病损部位迁移的能力［10］。(3)MSC在脑梗死区域可产生一系列BDNF和VEGF，起到神经保护和血管再生的作用［7］。但具体的作用机制尚未明确，有待进一步的研究验证。

培养得到的BMSCs静脉输注后，至今未观察到严重不良反应，初步说明此技术方法是安全的。本组病例数少，观察时间尚短，必须密切关注安全方面的问题，有待进一步进行大规模临床试验加以验证。

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3 陈清棠.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准及临床疗效评定标准［J］.中华神经科杂志，1996，29(6):381-383.

4 张成.骨髓干细胞移植在神经疾病中的应用前景［J］.医学文选，2003，22(5):1-3.

5 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isalation of putative progenitor Endothelial cell for angiogenesis ［J］.Science，1997，275(2):964-967.

6 Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Transpantation of exvivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3422-3427.

7 Chen X，Kalakowshi M，Li Y，et al.Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts growth factor production ［J］.J Neuro Sci Res，2002，69:687-691.

8 杜建时，孙大军.丹参及血管内皮生长因子对动物肢体缺血模型侧支循环建立的作用［J］.吉林大学学报 (医学版)，2003，29(3):294-297.

9 陈运贤，陆英，钟雪云，等.粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗大鼠缺血性脑梗死［J］.中国病理生理杂志，2004，20(6):560-565.

10 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infracted heart improving function and survival［J］.Proc N atl Acad Sci USA，2001，98:10344-10349.