本事琥珀散对子宫内膜异位症大鼠Th1/Th2漂移的影响*

★ 刘丹彤 张小勇 马小娜 王冬 赵伟鹏 孙良明 赵妍 王庆国 (北京中医药大学2009级博士研究生 北京00029;2.北京中医药大学 北京00029)

子宫内膜异位症(EMs)是指具有生长能力的子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位的一种疾病，以痛经、性交不适、不孕等为主要临床症状［1］。近年来，EMs发病率有逐年上升的趋势，且治疗后复发率高，成为育龄期妇女的常见病、多发病，严重影响女性的生活质量。本事琥珀散出自宋·许叔微的《普济本事方》，由三棱、莪术、赤芍、刘寄奴、丹皮、肉桂、熟地、当归、乌药、元胡组成，具有行气活血，温经止痛的功效，本为治疗女子痛经所设，现代亦常用来治疗子宫内膜异位症、输卵管阻塞性不孕等妇科疾病。在EMs的发病过程中，免疫失衡具有重要意义。Th1/Th2细胞的相互关系能够反映机体的免疫状态，因此Th1/Th2漂移与EMs密切相关。本研究拟探讨本事琥珀散对EMs Th1/Th2细胞漂移的影响，为寻找本事琥珀散治疗EMs的作用靶点打下基础。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级SD雌性成熟未孕大鼠，体重180g－200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK(京):2008－0001，标准化环境(湿度:50% －70%，12h昼夜交替)饲养，每笼5只，予以灭菌饲料及饮水。

1.2 实验药品

本事琥珀散组成及用量:三棱10g，莪术10g，赤芍 15g，刘寄奴 10g，丹皮 6g，肉桂 10g，熟地 10g，乌药10g，元胡10g，当归15g。药物剂量来自王庆国教授经验用量。饮片均购自北京中医药大学国医堂门诊部，由北京同仁堂药店提供。药物经水浸泡半小时，煎煮40min后倒出药液，再加水煎煮25min，将两次煎得的药液混合后加热浓缩得到浓缩液。达那唑胶囊由江苏联环药业股份有限公司生产(生产批号:20110102)。将胶囊打开，药粉兑入蒸馏水中，按比例配制成悬浮液。以上药品配制完成后置于4℃冰箱保存备用，每周更换一次药液。

水合氯醛，天津市光复精细化工研究所，批号:20071129;注射用氨苄西林钠，中诺药业(石家庄)有限公司生产，批号:09089024;己烯雌酚，合肥久联制药有限公司，批号:20080616;生理盐水由中诺药业(石家庄)有限公司生产，批号:20090123。IFN-γ、IL-4试剂盒，德国BENDER公司。

2 方法

2.1 分组及给药

50只SD大鼠随机分为5组，即正常组、伪手术组、疾病模型组、本事琥珀散组和达那唑组。正常组常规饲养;伪手术组做大网移植;疾病模型组、本事琥珀散组和达那唑组均采用自体移植法复制子宫内膜异位症模型。，于术前第5天和术后第10天开始给予己烯雌酚灌胃0.02 mg/kg，连续5 d，使手术时大鼠统一处于动情期;术后给予氨苄青霉素肌注16万 u/kg，连续5 d。

造模1周后，各组开始灌胃给药，连续4周。正常组和疾病模型组给予2ml生理盐水灌胃，每日1次。其余各组药量参照文献换算，本事琥珀散组按成人公斤体重的8倍给药(含生药量为14g)，达那唑组按成人公斤体重的8倍给药，16 mg/200g。

2.2 模型制作

(1)取雌性成熟未孕SD大鼠，于术前第5日和术后第10日开始给予己烯雌酚0.02mg/kg灌胃，每日一次，连续5日，使手术时大鼠统一处于动情期。

(2)手术在室温23℃ ～28℃环境下进行，无菌操作。以10%水合氯醛(0.4ml/100g，腹腔注射)麻醉大鼠。

(3)待麻醉后，将大鼠固定于手术板上，腹部备皮，常规消毒铺巾。选取尿道口上端约1cm处为切入点，沿腹中线切开1.5～2 cm的纵形切口，逐层分离腹壁进入盆腔。探查大鼠子宫(呈V型)，细丝线结扎左侧局部子宫血管以及需切除的子宫上下端。

(4)取大鼠左侧子宫角长约1～2 cm，立即放入PBS溶液中，修剪去除子宫浆膜外的脂肪组织，纵向切开子宫腔，切取5×5 mm大小的子宫片段，使其内膜面与右侧腹膜相对，用5－0号丝线将其四角缝于右侧腹壁，缝合处尽量远离手术切口，以减少组织粘连，并防止取材再次开腹时损伤已种植的异位组织。剩余部分子宫片进行组织学观察，以证实移植物确为子宫内膜组织。

(5)关腹前向腹腔滴入以0.9%生理盐水溶解的氨苄青霉素16万u/kg进行腹腔消毒，逐层缝合关腹。术后第1日开始给予氨苄青霉素16万u/kg肌肉注射，每日一次，连续5日。

(6)术后大鼠分笼单放，自然苏醒，常规饲养。

建模4周后随机选取2只模型大鼠开腹检查移植物生长情况，并送病检，验证造模效果(结果如下图)。

由上图可见，疾病模型大鼠手术4周后移植物体积明显增大，呈圆形，内有半透明囊液，表面有结缔组织覆盖和血管形成，质软。病理检查可见正常大鼠子宫内膜上皮细胞排列整齐，呈长柱状，肌层较厚，结构完整，腺体和血管丰富;疾病模型大鼠移植物囊内壁有内膜上皮细胞及间质细胞生长，上皮细胞呈低柱状，较扁平，细胞结构不清，肌层较薄，腺体较少。根据大体观察以及病理检查结果，可以认为EMs模型复制成功。

2.3 成模标准

取材时开腹观察移植物，可见移植物体积增大，呈圆形或椭圆形囊泡，内有透明或半透明囊液，部分为粘稠不透明液体，表面有血管形成。用游标卡尺测量移植物体积，根据Katsuki方法:体积(V)=长×宽×高，移植物体积≥8mm3者，即为模型复制成功［2、3］。

2.4 指标检测

于造模后第5周，用10%的水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉动物，开腹(开腹时尽量避开造模时子宫内膜种植部位)后，腹主动脉采血，用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4水平。

2.5 统计分析

3 结果

与正常组比较，疾病模型组大鼠血清IFN-γ和IL-4含量分别呈升高和降低趋势;与疾病模型组比较，本事琥珀散组IFN-γ和IL-4均有所降低和升高。疾病模型组IFN-γ/IL-4较正常组明显升高，较本事琥珀散组明显降低，组间比较差异有显著性(P＜0.05)。见下表。

本事琥珀散对EMs大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影响，注:与疾病模型组相比★P ＜0.05。

4 讨论

作为适应性免疫应答的功能组成部分，T细胞在人体的免疫系统中占有重要地位，其中的辅助性T淋巴细胞(Th)与EMs存在着密切联系。经抗原刺激的前体细胞(Thp)分化而来的Th0经细胞因子等多种因素影响向Th1或Th2分化发育。Th1、Th2细胞既在增殖分化的过程中受到细胞因子的影响，分化后又通过分泌多种细胞因子参与免疫调节并抑制Th0向另一类型Th细胞分化。Th1、Th2细胞和这些细胞因子之间相互作用，相互制约，调节着机体的免疫平衡状态，维持正常的细胞免疫和体液免疫功能［4］。在某种状态下，Th1/Th2的动态平衡被打破，出现偏向Th1或Th2的优势应答，就称为Th1/Th2漂移［5］，会引起疾病的发生。目前已经证实，许多肿瘤和自身免疫性疾病患者体内均存在Thl/Th2漂移现象，且与肿瘤的恶性程度密切相关。

Th1细胞主要是在抗原激活了静息的细胞毒性T细胞(CTL)后协助其发育成为效应性T细胞，通过分泌细胞因子、激活巨噬细胞而介导细胞免疫效应和迟发性超敏反应。IFN-γ和IL-12通过信号传导使T细胞增值分化为Th1细胞，分化后的Th1细胞主要产生 IFN-γ、IL-2［6］。Th2细胞则主要辅助 B细胞增殖分化成浆细胞，产生抗体，介导体液免疫效应。IL-4是促进初始T细胞分化为Th2细胞的重要因子，而Th2细胞又会产生IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子。一般认为，在同种器官的移植中，Th1参与了急性移植物的排斥，而Th2则更易于诱导移植耐受［7］。IFN-γ 和 IL-4 作为 Th1、Th2 细胞分泌的特征性细胞因子其含量及比值的变化被认为能够间接反映 Th1/Th2 的平衡状态［8］。

Hsu等［9］在1997年发现EMT患者外周血单核细胞和腹腔液中Th1细胞群功能下降，并认为这可能对EMT的发生具有始动作用。此后，许多研究均发现［10］、［11］EMs患者血清和腹腔液中存在 IFN-γ、IL-2水平低于正常妇女，而IL-4、IL-10水平升高的现象。但亦有研究表明在EMs或合并不孕患者的腹腔液中 IL-2 有所增高［12］、［13］，并认为正是因为IL-2的增多，诱导、促进了多种细胞毒细胞的活性，增强了机体免疫应答，从而导致了炎症、疼痛和不孕的发生。

本实验结果显示:疾病模型组较正常组具有IFN-γ升高和IL-4降低的趋势，尤其是IFN-γ/IL-4明显升高。IFN-γ能够激活巨噬细胞和NK细胞活性，促进机体免疫反应，并激活血管内皮细胞，刺激ICAM-1表达，客观上为移植物的种植生长提供了条件。IL-4能够促进Th2细胞的分化、抑制Th1细胞增殖及应答。血清IFN-γ的升高和IL-4的降低提示机体免疫有由Th2向Th1漂移的倾向。考虑本实验中没有出现被认为是EMs发生始动因素的Th1向Th2漂移现象，可能是EMs患者和动物模型的差别造成的。EMs患者的异位内膜是主动异位，即首先是患者自身存在细胞免疫状态的低下，继而引起随逆流经血进入腹腔的子宫内膜成功逃脱免疫监视而种植下来;而EMs模型大鼠的异位内膜则是被动异位，即子宫内膜经人为剥离种植在腹腔，种植之前大鼠本身并没有机体免疫低下的情况存在。

本事琥珀散及达那唑均对EMs模型大鼠外周血Th2向Th1漂移的情况有纠正作用。虽然在IFN-γ和IL-4血清含量方面，本事琥珀散组和疾病模型组比较没有显著性差异，但IFN-γ/IL-4比值却存在明显变化。IFN-γ所代表的Th1细胞和IL-4所代表的Th2细胞之间存在一种相互抑制的关系。疾病模型组相较于正常组IFN-γ/IL-4比值的升高，提示Th1细胞占优势。此时，Th1细胞会凭借自身自分泌和旁分泌的功能，以及其所分泌细胞因子对Th2细胞的抑制作用，并且随着病情的发展，Th1细胞的优势被逐渐放大。而本事琥珀散组IFN-γ/IL-4比疾病模型组明显降低，说明在本事琥珀散的作用下，Th1细胞的优势被抑制，从而起到了对 EMs Th1/Th2漂移的调节作用。

本事琥珀散对细胞免疫的调节作用可能与其行气活血的功效有关。有研究［14］发现柴胡疏肝散能够调节肝郁证大鼠Th2向Th1漂移的现象。柴胡疏肝散是疏肝行气活血的代表方之一，因而可以推断行气活血功效在调节Th/Th2漂移方面有所作为，但其作用机制尚需进一步研究。至于本事琥珀散是否对Th1/Th2的漂移具有双向调节作用，即是否会对造成EMs发生的细胞免疫低下状态有改善作用，还需进一步的临床观察。

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