局部应用菟丝子总多糖对家兔骨折修复中TGF-β1表达的实验研究*

★ 李绪松 郑臣校 付光明 (广东省中山市中医院 中山528400)

中医骨伤科对骨折的治疗遵从于复位、固定、功能锻炼和三期辩证用药的一般原则。强调“肾藏精，主骨生髓”理论指导下的骨折用药方法。结合临床用药经验，以及现代药理对中药多糖类的研究进展，我们对菟丝子总多糖进行了创新性使用，观察菟丝子总多糖局部应用对家兔骨折的修复TGF-β1表达情况。以说明补肾中药促进骨折修复的可行性和部分内涵。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组

选用健康成年家兔63只，体重(2.3±0.3)kg，按性别随机分为三组:菟丝子总多糖组(A组)、BMP/明胶复合物组(B组)以及空白对照组(C组)。每组21只兔。

1.2 主要实验试剂与器材

菟丝子总多糖(广州中医药大学药学院中药制剂室提供);人骨形态发生蛋白(human bone morphogenetic protein，rhBMP)(天津中津生物发展有限公司提供);明胶(成都科龙化工试剂厂生产);TGF-β1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产);DAB(二氨基联苯胺)显色液(武汉博士德生物工程有限公司生产);戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站分装厂进口分装);Leitz wetzlar 1512型石蜡切片机(德国生产);CK-2型普通光学显微镜(日本Olympus公司生产)。

2 实验方法

2.1 实验动物的造模

以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉成功。家兔取仰卧位，四肢固定于自制兔板上，搬运至手术台上。通过胫腓骨前外侧入路，切口约5～6 cm，逐层切开皮肤、皮下组织及关节囊，显露家兔胫骨。尽量不损伤骨膜。使用线锯将胫骨截断，并形成一约0.5 cm的骨缺损区域。庆大霉素-生理盐水冲洗后，对A、B、C三组分别给予中药菟丝子总多糖、BMP/明胶复合物以及空白处理。然后逐层缝合骨膜及肌肉、筋膜层以及皮肤切口。术后伤口外涂红霉素眼膏，每只动物每天肌注青霉素钠3?105 U，每天一次，共7天。常规进食，分笼饲养，自由活动，予以夹板外固定。术后2、4、8周，沿原手术切口取下骨折的胫骨，修剪周围的软组织，用4%多聚甲醛固定，4℃过夜，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗，置入20%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)pH值7.4的磷酸缓冲液中，室温下脱钙10天，中间换液一次，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡4 h，软蜡包埋。切片厚度5 μm，37℃烤片过夜。行TGF-β1免疫组化;并处死动物送标本。8周处死所有实验动物。

2.2 观察指标及测定方法

应用TGF-β1免疫组化的方法，切片经二甲苯脱蜡4 h，梯度酒精水化，0.3%过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶，5%羊血清封闭后，加1∶100稀释的兔抗鼠TGF-β1抗体，4℃过夜，复温冲洗后加1∶300稀释的羊抗兔抗体，37℃孵育30 min，冲洗后再加1∶300稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，37℃孵育30 min，冲洗后用二氨基联苯胺(DAB)显色，梯度酒精脱水二甲苯透明后封片。观察各组术后切片修复组织的积分光密度值(IOD)并进行统计学分析。

2.3 统计学处理

应用SPSS11.5统计软件处理:计量资料，以均数加减标准差(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);经正态分布检验，方差齐性检验用Homageneity of variance test。

3 实验结果

3.1 一般情况

术后实验动物切口均于5～7天愈合，A组1只共1个骨折端，B组2只共2个骨折端，C组1只共1个骨折端术后2～3天曾出现肿胀积液，给予消毒后穿刺积液抽吸为淡黄色质稀液体。

3.2 TGF-β1 免疫组化

免疫组织化学主要原理是用标记的抗体对细胞或组织内相应的抗原进行定性、定位和定量检测。其优点是具有高度的特异性、敏感性和精确性。阳性结果时采用了对切片修复组织的积分光密度值(IOD)进行统计。IOD能反映出被测个体截面或投影轮廓内总的吸光度，由各像素点光密度值直接相加，表示组织细胞截面或投影轮廓内染色的深浅总量。

表1 TGF-β1免疫组化IOD组间比较(±s)

表1 TGF-β1免疫组化IOD组间比较(±s)

与空白组比较:△P ＜0.05，★P ＜0.01。

组别 标本数量 2周 4周 8周A 组 7 59.25 ±12.47★ 84.86 ±22.57★ 76.96 ±19.57★B 组 7 56.67 ±15.43 76.81 ±24.49★ 68.17 ±7.66★C组7 37.48 ±13.54 31.83 ±9.26 27.62 ±8.32

由表1可以看出:2、4、8周时，中药组、BMP组TGF-β1免疫组化积分光密度值与空白组比较，都有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05);中药组与BMP组比较无统计学意义(P＞0.05)。提示:菟丝子总多糖及BMP/明胶复合物能够提高修复组织的TGF-β1分泌表达，为骨折修复组织的生长、塑形提供基质材料。

4 结论

菟丝子总多糖与空白组比较在2、4、8周均有显著性差异;与BMP组比较没有统计学意义，但表现出一定的优势。提示在骨折愈合的不同阶段，产生TGF-β1的细胞是不同的，表达量也不同，上述变化与组织学改变密切相关。而且与相应细胞的功能状态密切相关，这说明菟丝子总多糖可促进TGF-β1参与调节骨折修复。一定程度证实了利用补肾中药菟丝子对骨折损伤的修复作用，也符合骨折治疗中强调补肝肾补气血的用药原则。

5 讨论

传统中医药在骨折治疗中发挥着重要作用，其治疗原则仍以骨折复位、固定、功能锻炼为一般原则，临床用药遵从三期辩证用药。目前大部分报道集中在复方制剂对促进骨折愈合的临床疗效观察和单味中药有效单体成分实验观察阶段。随着分子生物学、组织工程、基因工程的研究深入，中医对骨折损伤的理论应当有所针对性创新，并对有利于骨折修复的补肾活血类中药有效药用成分以及药理作用环节进行明确的研究。有学者研究表明［1］，TGF-β1表达量和组织学分布的变化与骨折愈合过程中相应的组织学变化密切相关，而且与相应细胞的功能状态相关，说明TGF-β1是调节骨折愈合过程的重要因子以便在骨折修复修复领域发挥更重要的作用。

现代医学研究提示菟丝子能够促进造血功能，能促进骨髓造血干细胞的增殖，而髓腔内干细胞同时包括了骨髓间充质干细胞，为菟丝子补肾生髓养骨提供了依据。王建红等［2］发现菟丝子黄酮能下调心理应激大鼠下丘脑神经递质β-EP，上调腺垂体L H水平。现代药理学研究［3］表明:菟丝子还能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂质过氧化，增强体液免疫功能;具有一定的神经营养样作用和类似雌激素样作用，通过作用于不同的靶腺轴起到调节骨软骨代谢的作用。现代药理学研究提示多糖可能是补肾药药理作用的重要基础，目前研究较多的有枸杞多糖、菟丝子总多糖、地黄多糖、黄芪多糖、人参多糖以及六味地黄多糖等复方多糖。它们的共同功效包括［4］:能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂质过氧化等;菟丝子总多糖同时具有良好的成膜性和凝胶化能力，对温度和PH值稳定性好，具有生物相容性和生物降解性，水溶性好。通过制成水凝胶具有定形和缓释作用，在既往试验中，有学者［5］观察到菟丝子总多糖凝胶在骨质缺损内2～4周内完全吸收，与促进Ⅱ型胶原mRNA表达四周达峰一致。并且与BMP凝胶组没有明显差异，而且略有优势，菟丝子总多糖凝胶发挥了促进骨折修复因素与临时基质结合体的作用。

本次实验，通过对菟丝子总多糖的创新性使用，提示可能在骨组织工程中种子细胞的体外培养以及辅助各种生长因子实现增效方面发挥积极的作用。在骨折愈合的不同阶段，TGF-β1是参与调节骨折修复的重要因子。但机体对骨折愈合过程的调控是复杂的，单一因子不能解释其全部内容［6］。关于骨折愈合过程中应用菟丝子总多糖等类似的中药提取物对其它相关因子表达的影响，以及生长因子局部应用促进骨折愈合等问题，尚待进一步研究。本实验所选菟丝子的多糖成份有很强粘合的作用，既有对骨折断端的固定粘接功效，又可促进骨折的修复，具双重作用，在目前骨折的修复治疗中具有极强的创新性。是对中药利用传统认识结合现代药理、病理进展提示做出的一次大胆尝试，对我们日后研究中医理论、开发新药提出了更广阔的道路。有利于拓展中药的使用范围，增加新的给药途径和提高临床疗效，从而提高中医药的竞争力，更好的为人类健康谋福利。

［1］姬洪全，党耕町，马庆军，等.骨折愈合过程中转化生长因子β1表达的实验研究［J］.中华外科杂志，1998，36(2):72－73.

［2］王建红，王敏璋，欧阳栋，等.菟丝子黄酮对心理应激雌性大鼠下丘脑 β-EP 与腺垂体 FSH、LH的影响［J］.中药材，2002，12(25):886－888.

［3］何清义，李起鸿，杨柳，等.人关节软骨细胞的永生化及其表型的诱导［J］.中华创伤杂志，2002，18:727 －731.

［4］张振明，蔡曦光，葛斌.许爱霞女贞子多糖和菟丝子总多糖的协同抗衰老作用及其机制［J］.中国药理学通报，2005，5(21):587－590.

［5］林慧彬，林建群，林建强.山东4种菟丝子生物学特性研究［J］.中国野生植物资源，2008，1(28):34 －35.

［6］李瑛，邹季，熊勇，等小夹板固定对实验性骨折愈合的VEGF及TGF-β1 表达的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2007，15(9):32－35.