盐霉素抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP增殖及诱导凋亡的机制

曾 葭， 刘成成， 祝爱珍， 陈小宇， 谭广销， 刘革修△

(1中国人民解放军411医院呼吸内科，上海 200081；2暨南大学医学院血液病研究所, 广东 广州 510632)

1000-4718(2012)05-0834-05

2012-03-02

2012-03-12

△通讯作者 Tel:020-85220262; E-mail:tliugx@jnu.edu.cn

盐霉素抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP增殖及诱导凋亡的机制

曾 葭1， 刘成成2， 祝爱珍2， 陈小宇2， 谭广销2， 刘革修2△

(1中国人民解放军411医院呼吸内科，上海 200081；2暨南大学医学院血液病研究所, 广东 广州 510632)

目的探讨盐霉素对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能机制。方法采用MTT法检测盐霉素对A549/DDP细胞生长的抑制作用；流式细胞术检测盐霉素对A549/DDP细胞凋亡及线粒体膜电位(ΔΨm)的影响；比色法检测caspase-3、8和9活性；Western blotting分析细胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6(p-LRP6)蛋白水平。结果盐霉素对A549/DDP细胞生长具有剂量依赖性抑制作用。0.2 μmol/L盐霉素作用于A549/DDP细胞，ΔΨm显著下降，而细胞内活性氧和Ca2+浓度在短期显著升高，胞浆细胞色素C蛋白水平、caspase-3、8和9酶活性均显著增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；Bcl- 2 的表达下调，Bax 的表达明显增加，Bcl-2/Bax 比值显著降低。48 h时增殖抑制率为(34.61±1.97)%，细胞凋亡率为(18.74±2.08)%。盐霉素也减少A549/DDP细胞内β-catenin和p-LRP6蛋白水平。结论盐霉素通过抑制Wnt信号通路抑制A549/DDP细胞增殖，通过Bcl-2/Bax途径和线粒体凋亡途径诱导人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP凋亡。

盐霉素; 肺肿瘤; 顺铂; 细胞凋亡; β-catenin; 低密度脂蛋白受体相关蛋白6

肺癌是目前发生率与死亡率最高的恶性肿瘤,其中以非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)为主,而且NSCLC患者确诊时多数已到晚期，手术难以彻底清除,以铂类为基础的两药联合化疗方案和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)是当前针对EGFR基因突变的晚期NSCLC患者首选治疗措施,但对EGFR基因不存在突变者只有少数治疗有效，而且多数容易出现耐药复发现象。越来越多的研究表明,肿瘤耐药与复发的根本原因是肿瘤干细胞的存在。因此，寻找新的清除肿瘤干细胞的药物以减少耐药与复发十分必要。最近Gupta等[1]研究发现一种名为盐霉素(salinomycin)的抗生素可以直接杀死肿瘤干细胞，其杀死小鼠乳腺癌干细胞的效力比普通抗癌药物泰克索(Taxol)高100倍。本实验观察盐霉素对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能机制，为盐霉素应用于肺腺癌治疗探索新的思路。

材 料 和 方 法

1主要试剂

盐霉素(S4526)、台盼蓝(T0776)、Triton X-100(T8787)、DMSO(D2650)和PI染料(P4170)购自Sigma, RPMI-1640 培养液(R0883)和胎牛血清(10082-139)购自Gibco，细胞内活性氧(S0033)、caspase-3酶活性(C1115)、caspase-8酶活性(C1152)、caspase-9酶活性(C1158)以及JC-1线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)检测试剂盒(C2006)购自碧云天生物技术有限公司，细胞色素C凋亡检测试剂盒(Catalog BioVision)，Fluo-3AM(Biotium)，Epics XL 型流式细胞仪(Beckman Coulter)。

2细胞和细胞培养

人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP购自中南大学湘雅医学院细胞中心。用含10% 胎牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg链霉素的 RPMI-1640培养液置于含5% CO2、饱和湿度、37 ℃孵箱中培养，2～3 d传代。

3盐霉素对细胞生长的抑制作用

检测盐霉素对A549/DDP细胞的剂量-效应关系时，取对数生长期细胞，调整密度为5×107/L，每孔180 μL，盐霉素设有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L浓度梯度，设5个复孔，同时设DMSO对照孔和不加细胞的调零孔，5%CO2、饱和湿度、37 ℃孵育48 h，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37 ℃培养4 h后低速离心10 min,吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡15 min使沉淀充分溶解，用酶标仪在波长490 nm处测定吸光度(A)值。细胞生长抑制率=(实验组平均A值-空白组平均A值)/(对照组平均A值-空白组平均A值)×100%。采用直线回归方法计算药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。绘制0.2 μmol/L盐霉素对A549/DDP细胞的时间-效应曲线，孵育时间：0、24、48、72、96 h，测量方法同上。

4AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡

取对数生长的A549/DDP细胞，每孔2×105个细胞接种至12孔板内，设盐霉素(0.2 μmol/L)处理组、盐霉素(非细胞毒性浓度0.1 μmol/L)与顺铂(2 mg/L)联合处理组、单纯顺铂(2 mg/L)组和对照组，对照组加入1% DMSO，作用48 h后，消化收集细胞，PBS 洗涤，弃上清，加入200 μL结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，轻轻混匀，4 ℃避光反应30 min，再加入300 μL结合缓冲液，上机检测。

5ΔΨm、活性氧和胞质Ca2+释放的检测

取对数生长期的A549/DDP细胞，以每孔2×105个细胞接种至12孔板，加入盐霉素(0.2μmol/L)处理，在6 h、12 h、24 h时收集细胞，PBS洗涤2遍。500 μL JC-1(10 mg/L)重悬细胞检测ΔΨm，500 μL DCFH-DA (5 μmol/L)重悬细胞检测细胞产生的活性氧，10 μmol/L荧光染料 Fluo-3AM检测细胞内Ca2+浓度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm, 发射波长为530 nm。

6检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性

取对数生长期的A549/DDP细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种至12孔板，加入盐霉素(0.2 μmoL/L)，分别处理0、12、24 h, 按照试剂盒说明收集细胞，预冷PBS洗涤后重悬于细胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000×g离心10 min，取上清加入显色底物(caspase-3底物Ac-DEVD-pNA、caspase-8底物Ac-IETD-pNA和caspase-9底物Ac-LEHD-pNA)，终浓度50 μL/L，均匀混合并加入到96孔板中，每组5个复孔，避光孵育4 h，酶标仪在波长405 nm处检测A值。

7Westernblotting检测蛋白水平

取对数生长期的A549/DDP细胞，分别以0.2 μmoL/L盐霉素处理48 h，收集细胞PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提总蛋白；细胞色素C凋亡测定是按试剂盒抽提胞浆及线粒体蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂测定蛋白浓度，取蛋白50 μg，经10% SDS-PAGE电泳分离，常规转移至PVDF膜，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭液(20 mmol/L Tris,pH 7.6;0.1% Tween 20)封闭过夜。鼠抗人细胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin抗体(Santa Cruz)、磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6(phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6,p-LRP6) (Ser1490)抗体 (Cell Signaling Technology)或GAPDH (Chemicon International) 4 ℃孵育过夜，1∶2 000 稀释的HRP 标记的山羊抗小鼠Ⅱ抗室温孵育1 h，用TBST洗3次，ECL显色液显色。目的条带用Image-Pro Plus分析软件进行灰度值分析，以GAPDH内参照校正。

8统计学处理

结 果

1盐霉素对A549/DDP细胞抑制生长和诱导凋亡的作用

盐霉素在0.1～1.6 μmoL/L之间对A549/DDP细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性：0.1 μmoL/L即有明显作用，0.2、0.4、0.8和1.6 μmoL/L盐霉素增殖抑制率分别为(34.61±2.97)%、(59.64±3.23)%、(83.75±3.32)%和(95.74±3.47)%，P<0.05，见图1A。根据实验数据计算得IC50=0.33 μmoL/L。0.2 μmoL/L盐霉素处理A549/DDP细胞24 h时即显示明显增殖抑制作用[(17.93±2.18)%]，随着时间延长抑制作用越来越明显，72 h细胞抑制率(51.43±3.24)%，96 h为(64.58±3.38)%，见图1B。流式细胞仪检测结果显示0.2 μmoL/L盐霉素能够诱导A549/DDP细胞凋亡，出现明显亚G1二倍体峰，且随着时间的增加，作用越明显，48 h时细胞凋亡(18.74±2.08)%，见图2。

图1盐霉素对A549/DDP细胞的生长抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of A549/DDP cells.

图2盐霉素诱导A549/DDP细胞凋亡

2盐霉素对A549/DDP细胞ΔΨm、活性氧和细胞内Ca2+浓度的影响

0.2 μmoL/L盐霉素作用于A549/DDP细胞之后，ΔΨm在6 h时已显著下降，24 h时下降至最低，为对照组的(21.7±2.3)%；细胞内活性氧在6 h时已显著升高，24 h时仍然高于对照组水平[(142.7±4.3)%]；细胞内Ca2+浓度在6 h时已显著升高，为对照组的(154.9±5.6)%，24 h时下降至接近对照组水平，见图3。

图3盐霉素对A549/DDP细胞线粒体膜电位、活性氧和细胞内Ca2+的影响

3盐霉素对A549/DDP细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影响

0.2 μmol/L盐霉素处理A549/DDP细胞后，随着时间的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9

的活性逐渐增加，呈时间-效应关系，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。这表明caspase-3、caspase-8和caspase-9参与了盐霉素的凋亡途径。

图4盐霉素对A549/DDP细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影响

4盐霉素对A549/DDP细胞Bcl-2、Bax、细胞色素C、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影响

0.2 μmol/L盐霉素作用A549/DDP细胞48 h，不仅Bcl- 2 表达下调，Bax 表达明显增加，使Bcl-2/Bax 比值显著降低，而且胞浆细胞色素C 显著增加，Wnt信号通路β-catenin和p-LRP6蛋白水平也显著下降，见图5。这说明盐霉素影响了Bcl-2/Bax和细胞色素C这2条凋亡途径，同时抑制A549/DDP细胞Wnt信号通路。

图5盐霉素对A549/DDP细胞中细胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影响

讨 论

盐霉素属于聚醚类一元羧酸，由白色链霉菌(Streptomycesalbus)发酵产生，具有特殊的环状结构，是典型的离子载体抗生素，它对细胞中的阳离子，尤其K+、Na+、Rb+的亲和力特别强，使生物所必需的阳离子通过膜上脂质屏障的浸透性增强，妨碍细胞内外阳离子的传递，使细胞内外离子浓度发生变化，从而影响渗透压，最终使细胞崩解，起到杀菌作用。

细胞凋亡程序是一个复杂的、涉及多基因的过程，主要有线粒体和细胞表面受体介导这两条途径。Bcl-2家族、线粒体细胞色素C及caspase是细胞内凋亡信号通路的基本成分[2-5]。Caspase被认为是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白，一旦活化发生级联反应，凋亡即进入不可逆的阶段。而caspase-3是caspase家族成员中最重要的效应型[6]。本研究结果显示，盐霉素对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞生长不仅具有剂量依赖性抑制作用，而且使ΔΨm下降、细胞色素C和Ca2+的释放，增加细胞内活性氧，以及增加caspase-3、8和9酶活性，并使Bcl-2/Bax 比值显著降低；流式细胞仪结果显示细胞凋亡明显增加。这些实验结果说明盐霉素通过Bcl-2/Bax途径和线粒体凋亡途径诱导人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP凋亡。另外，盐霉素也减少A549/DDP细胞内β-catenin和p-LRP6蛋白水平。Wnt信号途径对维持细胞生物学活性具有重要作用。最近研究显示Wnt信号途径与肿瘤干细胞增殖与自我复制及其耐药密切相关[7-9]。所以，结果说明盐霉素通过抑制Wnt信号途径抑制A549/DDP细胞增殖。这些实验结果对于改善肺腺癌临床治疗方法提供新的依据。但如何应用盐霉素于肺腺癌临床治疗还有待进一步研究。

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Salinomycininhibitedproliferationandinducedapoptosisofcisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomacelllineA549/DDP

ZENG Jia1, LIU Cheng-chen2, ZHU Ai-zhen2, CHEN Xiao-yu2, TAN Guang-xiao2, LIU Ge-xiu2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ChinesePLA411Hospital,Shanghai200081,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of salinomycin on the proliferation and apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP.METHODSThe inhibitory effect of salinomycin on the growth of A549/DDP cells was tested by MTT methodinvitro. The apoptosis and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of A549/DDP cells were assayed by flow cytometry. The activity of caspase-3, 8 and 9 was determined by the method of colorimetry. The levels of cytochrome C, Bcl- 2, Bax, β-catenin, and phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6(p-LRP6) were measured by Western blotting.RESULTSSalinomycin inhibited the growth of A549/DDP cells in a dose-dependent manner. Salinomycin at concentration of 0.2 μmol/L decreased ΔΨmlevel, and increased reactive oxygen species (ROS), cytochrome C and cytosolic Ca2+release in the cells. Salinomycin also increased the acti-vity of caspase-3, 8, and 9 in the cells, reduced the ratio of Bcl-2/Bax, and decreased the levels of β-catenin and p-LRP6.CONCLUSIONSalinomycin depresses the cell growth by inhibiting Wnt signaling, and induces the apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP via mitochondria-dependent and Bcl-2/Bax pathways.

Salinomycin; Lung neoplasms; Cisplatin; Apoptosis; β-catenin; Low-density lipoprotein receptor-related protein 6

R743

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.012