动态浊度法鲎试验用于检测人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素的研究

盛凤仙，熊可强，王惠之，张幼捷，高莉萍(上海新兴医药股份有限公司，上海 200135)

盛凤仙(1965-)，女，本科，执业药师.Tel:18918063565,E-mail:wlrssfx@citiz.net.

高莉萍.Tel:(021)50931037，E-mail:liping-gao@163.com.

动态浊度法鲎试验用于检测人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素的研究

盛凤仙，熊可强，王惠之，张幼捷，高莉萍
(上海新兴医药股份有限公司，上海 200135)

目的应用动态浊度法定量测定人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素含量。方法通过对样品中定量添加标准内毒素的干扰试验，检测其回收率应在50%～200%范围。结果将样品进行1→100稀释可以有效地消除其对鲎试验的干扰。结论应用动态浊度法定量测定人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素含量是可行的，与热原检查法结果一致。

人凝血因子Ⅷ；细菌内毒素；动态浊度法鲎试验；干扰试验

人凝血因子Ⅷ是我公司研发的产品，临床上主要用于预防甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症及这类病人的手术出血治疗[1～2]。依据2010年版《中国药典》三部规定，人凝血因子Ⅷ制品中热原检查是采用家兔法，但此法操作繁琐，时间长且费用高，不适于制品的生产过程控制和成品的大规模热原检测，故需建立一种快速测定的方法，用于人凝血因子Ⅷ生产过程中细菌内毒素含量的控制。有关动态浊度法鲎试验定量测定人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素含量的报道未见收载，故笔者参阅了有关文献[3～4]，初步建立了动态浊度法定量测定人凝血因子Ⅷ制品中细菌内毒素含量的方法。

1 材料

1.1仪器 Bioprobe-2002型细菌内毒素测定仪，XW-80A型旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)。

1.2试药 细菌内毒素检查用水(批号：1010130，规格，5 ml/支，湛江安度斯生物有限公司)；动态浊度法鲎试剂(批号：1010142，规格：1.25 ml/支，λ=10～0.03 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)；细菌内毒素工作标准品(批号：150601-200966，规格：90 EU/ 支，中国药品生物制品检定所)；人凝血因子Ⅷ(批号：20090503、20090605、20090607、20091112、20091213、0100706、20110804、20110805、20110906，规格：200 IU/瓶，本公司研究部提供)。

2 方法与结果

2.1细菌内毒素限值(L)的确定 采用细菌内毒素公式为：L=K/M，K为规定的给药途径，即人每千克体重每小时最大可接受的內毒素剂量，注射剂K=5 EU/(kg . h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量10 IU/(kg . h)，计算得样品的内毒素限值L为0.5 EU/IU。

2.2标准曲线制备及可靠性试验 将细菌内毒素工作标准品用1 ml 细菌内毒素检查用水溶解，置漩涡混合器上混合15 min，然后逐级稀释(每步不超过10倍)至最终细菌内毒素浓度分别为2、0.25、0.031 25 EU/ml，三个标准品溶液，各取0.1 ml分别加到预先加有0.1 ml动态浊度法鲎试剂反应管内，混匀，立即插入Bioprobe-2002型细菌内毒素测定仪内，37 ℃ 1 h自动检测，其中每个浓度重复3管，并同时作阴性对照2管。结果如下：实验数据按最小二乘法进行统计分析，得回归方程：lgTg=2.969 3-0.303 6 lgC(其中：Tg为透光度达到92%时反应时间(S)，C为内毒素浓度(EU/ml))；相关系数R=│-0.994 2│>0.980，阴性对照管的反应时间大于标准内毒素最低点的反应时间，变异系数CV%<10%，故标准曲线成立。见表1。

2.3干扰实验

2.3.1样品最大稀释倍数计算 公式为：MVD=LC/λ1，式中λ1为动态浊度法标准曲线中最低点细菌内毒素浓度0.031 25 EU/ml，L为供试品的细菌内毒素限值0.5 EU/IU；当L以EU/IU表示时，C为20 IU /ml，计算得Ⅷ因子最大有效稀释倍数MVD为320倍。

2.3.2样品溶液配制干扰实验 取人凝血因子Ⅷ样品(批号为20090503，规格为200 IU/瓶)用10 ml水复溶，然后用细菌内毒素检查用水稀释为5、50、100、200、300倍溶液，作为样品溶液，记为Ai液；同时进行同样倍数稀释，但在稀释液中添加了细菌内毒素标准溶液使终浓度为0.25 EU/ml，作为内毒素阳性对照管，记为Bi液；分别吸取上述各液0.1 ml，加入预先加有0.1 ml动态浊度法鲎试剂的试管内，混匀，立即插入Bioprobe-2002型细菌内毒素测定仪内，37℃ 1 h自动检测，其中每个浓度重复3管，计算回收率。回收率(%)=(Bi液内毒素值-Ai液内毒素值)/添加内毒素浓度λ×100%。结果如下：标准曲线：IgT=2.965 3-0.317 2 lgC；相关系数R=│-0.995 9│>0.980。在供试品稀释倍数中，1→5稀释液的平均回收率为28.02%，说明该稀释液对鲎试剂有抑制作用；1→50，1→100，1→200，1→300稀释液的平均回收率均在50%～200%范围内，符合《中国药典》2010年版三部规定，表明样品此4个稀释液对鲎试剂无干扰影响，其中1→100稀释液的平均回收率最接近100%，故在日常检测中，选用1→100稀释液。见表2。

2.4样品溶液验证试验 分别取3批人凝血因子Ⅷ(批号20110804、20110805、20110906，规格为200 IU/瓶)用10 ml水复溶，然后用细菌内毒素检查用水制成100倍稀释液，记为Ai液；；同时另取4管进行100倍稀释，并在稀释液中添加了细菌内毒素标准溶液使终浓度为0.25 EU/ml，记为Bi液；分别取上述各液0.1ml，加入预先加有0.1ml动态浊度法鲎试剂的试管内，混匀，立即插入Bioprobe-2002型细菌内毒素测定仪内，37℃ 1 h自动检测，其中每个浓度重复3管，计算回收率。结果如下：标准曲线：IgT=2.951 4-0.327 1 lgC；相关系数R=│-0.998 7│>0.980。三批样品的平均回收率均在50%～200%范围内，进一步验证了样品在本实验条件下对鲎试剂无干扰影响。见表3。

表2 批号20090503人凝血因子Ⅷ的干扰实验(n=3)

表3 人凝血因子Ⅷ样品的验证试验(n=3)

2.5样品的细菌内毒素定量检测 根据以上干扰试验结果对5批样品(批号为：20090605、20090607、20091112、20091213、20100706，规格：200 IU/瓶)以100倍稀释后进行定量检测，同时进行兔法热原检查。结果其平均回收率均在50%～200%范围内，并和家兔法检测结果基本一致，均符合规定，判合格。见表4。

表4 动态浊度法定量检测结果与家兔法检测结果的比较

3 讨论

3.1鲎试剂动态浊度法是采用专用仪器在适当波长范围内检测凝胶反应过程中的浊度(透光度)变化而确定供试品中内毒素含量的方法。待测样品中内毒素与鲎试剂的C因子反应，激活凝固酶切断凝固蛋白原中特定位置的精氨肽链，肽链凝固产生凝胶，根据测定反应液到达事先设定的浊度(透光度)值所需要的时间的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比关系而进行定量测量的一种分析方法。

3.2細菌内毒素与鲎试剂的反应是由一系列酶促放大作用产生的，其干扰因素主要包括供试品的酸碱度、金属离子浓度、非特异性鲎试剂激活物、对仪器检测光源的吸收干扰等因素。本实验干扰试验结果发现：用动态浊度法定量测定人凝血因子Ⅷ(1→100)稀释液中细菌内毒素，其回收率均在50%～200%，表明此条件下不存在干扰因素，且8批样品均在规定的限度0.5 EU/IU l以下，判为合格。

3.3鲎试剂动态浊度法与传统的家兔检查法相比，具有操作简单、准确、检测灵敏度高、可定量等优点，避免了由于家兔个体差异所致的假阳性或假阴性结果，能直观地反映样品中细菌内毒素多少，在试验的反应过程中可以动态观察并分析干扰情况。经过对比试验，样品的细菌内毒素定量检测结果与家兔热原检测结果基本一致，说明使用细菌内毒素动态浊度法测定Ⅷ因子制品中细菌内毒素是可行的。

[1] Van DK, Van Der Bom JG, Lenting PJ,etal. Facter Ⅷ half-life and clinical phenotype of severe hemophilia A [J]. Haematologica, 2005,90(4)：494.

[2] 赵艳华, 马 平, 卜凤荣. 凝血因子分子生物学研究进展[J]. 生物技术通讯，1999，10(2)：158.

[3] 国家药典2010版.三部[S]. 2010：95.

[4] 劳海燕，罗宇芬，林秋晓.动态比浊法用于检测生脉注射液中细菌内毒素的研究[J].广东药学学报，2002,18(1)：21.

DeterminationofbacterialendotoxininhumancoagulationfactorⅧbykineticturbidimetriclimulustest

SHENG Feng-xian，XIONG Ke-qiang，WANG Hui-zhi，ZHANG You-jie，GAO Li-ping
(Shanghai Xinxing Medicine Co.,Ltd., Shanghai 200135, China)

ObjectiveTo establish a method for determination of bacterial endotoxin in human coagulation factor Ⅷ by kinetic turbidimetric limulus test.MethodsBased on interference experiment, the endotoxin was added in the samples, whose recovery should be within the range 50%～200%.ResultsThe interference from limulus test was eliminated by diluting the Human coagulation factor Ⅷ (1→100 solution).ConclusionsTurbidimetric-kinetic method was feasible, and had the same result with the rabbit-pyretogen test.

human coagulation factor Ⅷ；bacterial endotoxin；kinetic turbidimetric limulus test；interference test

R94

A

1006-0111(2012)02-0107-03

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.02.008

2011-12-22

[修回日期]2012-03-06

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