聚酰胺树脂提取血竭龙血素

乐 薇

（武汉长江工商学院工学院，湖北 武汉 430065）

聚酰胺树脂提取血竭龙血素

乐 薇

（武汉长江工商学院工学院，湖北 武汉 430065）

研究了聚酰胺树脂对血竭中龙血素A和龙血素B的提取效果。采用HPLC进行定量分析，考察了上样方法、洗脱剂体积分数、洗脱流速、树脂使用次数等因素对提取效果的影响，并确定了适宜的梯度洗脱方式。结果表明，将血竭样品用乙酸乙酯溶解后，与聚酰胺树脂混合，然后将溶剂蒸发完全进行吸附，树脂的吸附量为1 g·（g树脂）－1。在0.8 m L·min－1洗脱流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脱被聚酰胺树脂吸附的龙血素A和龙血素B，解吸率均达91%以上，聚酰胺树脂使用3次后即需再生。该工艺收率高、操作简便，适于血竭龙血素的提取。

聚酰胺树脂；提取；血竭；龙血素

血竭是名贵中草药，广泛应用于膏、丸、丹、散、片及雾剂等中成药产品中。随着血竭资源的不断开发及其成分分析、药理作用、毒性试验等方面研究的深入，血竭的临床应用前景非常乐观［1～3］。龙血素A和龙血素B是血竭中的重要指标成分，属于黄酮类化合物［4，5］。聚酰胺是分离黄酮类化合物较常用的吸附剂［6，7］，黄酮分子中富含的酚羟基与聚酰胺分子中的酰胺基因双方质子共享形成氢键而产生吸附，从而与不能形成氢键的组分分离，达到提纯的目的。作者利用聚酰胺树脂提取血竭中的龙血素，探讨了相关因素对提取效果的影响，并确定了适宜的洗脱方式。

1 实验

1.1 材料、试剂及仪器

血竭，云南云河药业有限公司。龙血素A、龙血素B对照品，广西中医药研究所。

乙酸乙酯，分析纯，天津津东天正精细化工试剂厂；无水乙醇，分析纯，上海振兴化工一厂；乙腈，色谱纯，上海陆都化学试剂厂。柱层析用聚酰胺（30～60目），上海第一化学试剂有限公司。

2537A型紫外分析仪，上海科艺光学仪器厂；L－7000型高效液相色谱仪，日本日立；Agilent C18（4.6 mm×150 mm）色谱柱，北京先明乐施科技发展有限公司；Lambda35型紫外可见分光光度计，PE公司；RE－52型旋转蒸发器，上海安亭电子仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 吸附方法的选择

参照文献［8］对聚酰胺树脂进行预处理。再向其中加入用乙酸乙酯溶解的血竭样品原液，于80℃水浴中蒸发溶剂，并不时加以搅拌，直至溶剂蒸发完全。

分别考察不同血竭样品与聚酰胺树脂的质量比、吸附时间的吸附效果。

1.2.2 洗脱条件的选择

在一定流速下，用乙醇对已吸附血竭样品的聚酰胺树脂进行解吸，计算龙血素A／B的解吸率及洗脱剂的用量。

1.2.3 龙血素A／B的 HPLC测定

（1）色谱条件

流动相为乙腈－1%冰醋酸（34∶66，体积比）；流速1.0 m L·min－1；检测波长280 nm；灵敏度0.02 UFS；柱温40℃。上述色谱条件下，龙血素A的保留时间为29 min，龙血素B的保留时间为32 min，二者分离度为1.7。

（2）标准曲线的绘制

将龙血素A对照品储备溶液分别配制成浓度（μg·m L－1）为4.9、9.8、14.7、19.6、25.5、29.4的对照品溶液，经微孔滤膜过滤器（0.45μm）滤过，在上述色谱条件下进样20μL，记录色谱图，进样浓度（c）与峰面积（A）的回归方程为：A＝612682.1c＋764068.5，相关系数R＝0.9996；线性范围为6.3～127μg·m L－1。

将龙血素B对照品储备溶液分别配制成浓度（μg·m L－1）为2.16、4.32、6.48、10.80、12.90的对照品溶液，经微孔滤膜过滤器（0.45μm）滤过，在上述色谱条件下进样20μL，记录色谱图，进样浓度（c）与峰面积（A）的回归方程为：A＝542225.4c＋1760149；相关系数R＝0.9993；线性范围为8.55～171μg·m L－1。

2 结果与讨论

2.1 吸附方法的选择

由于在聚酰胺树脂上稀碱的洗脱能力强于乙醇，所以不能采用氢氧化钠溶解血竭样品上柱的方法。但改变上柱液的p H值至酸性范围，血竭样品原液几乎不溶解，也不能被聚酰胺吸附，因此必须采用其它上柱方法。实验发现，将血竭样品用有机溶剂溶解后，与聚酰胺混合，然后将溶剂蒸发完全，可实现血竭样品的吸附。

2.2 吸附条件的选择

2.2.1 血竭样品与聚酰胺树脂的质量比

在一定量的聚酰胺树脂中加入不同质量的血竭样品原液（乙酸乙酯溶解），考察吸附效果，结果见表1。

表1 聚酰胺树脂对血竭样品的吸附效果Tab.1 Adsorption of dragon′s blood（dissolved in EtOAc）by polyamide resin

由表1可知，当血竭样品与聚酰胺树脂的质量比为1∶1时，聚酰胺即可达到吸附饱和，故选择血竭样品与聚酰胺的质量比为1∶1。

2.2.2 吸附时间

吸附时间亦即溶剂蒸发完全的时间。将3.5 g血竭样品用3 m L乙酸乙酯溶解后，与3.5 g聚酰胺树脂混合，置于80℃水浴中，每隔10 min观察一次溶剂蒸发情况，发现30 min即可将溶剂蒸发完全。

2.3 洗脱条件的选择

2.3.1 洗脱剂

洗脱剂的选用是影响吸附树脂使用效果的重要环节，优选洗脱剂能提高产物的质量和吸附树脂的使用效率。要求吸附质与洗脱剂的亲和力大于吸附质和吸附剂的亲和力，同时还要求洗脱剂有较低的沸点、易于蒸馏回收，实验发现，乙醇作洗脱剂效果较好。

2.3.2 洗脱剂体积分数

用不同体积分数的乙醇对已吸附血竭样品的聚酰胺树脂进行解吸，结果见表2。

表2 乙醇体积分数对洗脱血竭龙血素的影响Tab.2 The effect of volume fraction of ethanol on desorption of loureirin in dragon′s blood

由表2可知，乙醇体积分数较低时（如30%），龙血素A、龙血素B不能解吸；50%乙醇作洗脱剂时，龙血素A、龙血素B解吸率均达到91%以上；继续增大乙醇体积分数，龙血素A、龙血素B的解吸率反而下降。这可能是由于，乙醇体积分数较高时，其它的黄酮类化合物比龙血素A、龙血素B更易解吸，从而使龙血素A和龙血素B的解吸率下降。因此，选用50%的乙醇作洗脱剂。

2.3.3 洗脱流速

流速是柱层析分离的一个重要指标，流速过快会缩短分离时间，同时也使洗脱剂耗费更多；流速过慢虽然可以提高分离效果，但延长了分离时间。在不同流速下，用50%乙醇对已吸附饱和的聚酰胺树脂进行解吸，当流出液中未检测到龙血素时即认为洗脱完全，结果如图1所示。

图1 洗脱流速对聚酰胺树脂洗脱情况的影响Fig.1 The effect of eluting velocity on the desorption for polyamide resin

由图1可知，随着洗脱流速的加快，洗脱液体积增大，洗脱时间缩短；洗脱流速为0.8 m L·min－1时所需洗脱液体积稍大于洗脱流速0.5 m L·min－1时的洗脱液体积，但前者比后者解吸时间短，所以选择适宜的洗脱流速为0.8 m L·min－1。

2.3.4 梯度洗脱

聚酰胺树脂对不同黄酮类化合物的亲和作用有差异，对饱和吸附血竭的聚酰胺树脂进行梯度洗脱，洗脱剂的体积分数分别为30%、50%、70%、90%。对各梯度洗脱部分所得干燥物进行HPLC分析，其色谱图见图2（a～c）（90%乙醇洗脱物在检测条件下无色谱峰，未列出），图2d是血竭全粉的HPLC色谱图。

图2 梯度洗脱物（a～c）和血竭全粉（d）的HPLC色谱Fig.2 The HPLC chromatograms of gradient eluate（a～c）and dragon′s blood powder（d）

进一步计算出各部分龙血素A和龙血素B的含 量，结果列于表3。

表3 聚酰胺树脂的梯度洗脱结果Tab.3 The results of gradient elution for polyamide resin

由表3可知，50%的乙醇能将绝大部分的龙血素A和龙血素B洗脱下来，洗脱率均在91%以上。

2.4 树脂重复使用次数的考察

在上述确定的吸附、洗脱条件下，考察聚酰胺树脂使用次数对血竭中龙血素吸附和解吸的影响，结果见表4。

表4 聚酰胺树脂使用次数对血竭龙血素吸附和解吸的影响Tab.4 The effect of frequency of use of polyamide resin on adsorption and desorption of loureirin in dragon′s blood

由表4可知，随着吸附次数的增多，聚酰胺树脂对血竭龙血素的吸附量呈下降趋势，尤其是使用3次以上时更为明显。这是因为，乙酸乙酯提取物中含有50%乙醇无法洗脱的难洗脱物，它们被吸附在聚酰胺树脂表面，随着吸附次数的增加，难洗脱物在树脂上累积，降低了树脂的有效吸附容量。同时，随着吸附次数的增加，聚酰胺树脂对血竭龙血素的解吸量也有所下降，其原因可能是树脂上的难洗脱物对血竭龙血素也有一定的吸附作用。因此，重复使用3次后应对树脂进行再生。

3 结论

将血竭样品用乙酸乙酯溶解后，与聚酰胺树脂混合，然后将溶剂蒸发完全进行吸附，血竭中龙血素的吸附量为1 g·（g树脂）－1。在0.8 m L·min－1的洗脱流速下，7 BV的50%乙醇可梯度洗脱被聚酰胺树脂吸附的龙血素A和龙血素B，解吸率均高于91%。该工艺收率高，操作简便，适用于血竭龙血素的提取。

［1］ 付梅红，方婧，王祝举，等.血竭药理研究与临床应用概述［J］.时珍国医国药，2010，21（6）：200－202.

［2］ 刘芳，戴荣继，邓玉林，等.龙血竭化学成分研究进展［J］.中国药房，2010，21（15）：99－101.

［3］ 樊兰兰，屠鹏飞，何鉴星，等.中药龙血竭原植物剑叶龙血树的形态组织学研究及所含树脂的分布和成分检测［J］.中国中药杂志，2008，33（10）：1112－1117.

［4］ 高秀丽，蒋蒨，王鹏娇，等.龙血竭高效液相色谱特征研究［J］.中国中药杂志，2007，32（19）：2024－2025.

［5］ 胡迎庆，李灵芝，韩慧文.RP－HPLC测定龙血竭中龙血素A和B的含量［J］.药物分析杂志，2003，23（1）：7－8.

［6］ 吴立军.天然药物化学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：185.

［7］ 黄松，丁婕，陶艳，等.聚酰胺树脂精制甜茶总黄酮的工艺研究［J］.中国新药与临床药理，2010，21（3）：311－315.

［8］ 史伟国，祖元刚，杨磊，等 .聚酰胺分离纯化喜树果中10－羟基喜树碱和喜果苷的研究［J］.中国中药杂志，2008，33（21）：2486－2489.

Abstraction of Loureirin A and B in Dragon′s Blood by Polyamide Resin

YUE Wei
（Engineering Institute of Wuhan Yangtze Business University，Wuhan430065，China）

The abstraction of loureirin A and B in dragon′s blood by polyamide resin was studied.The effect of sampling method，eluent volume fraction，eluting velocity，frequency of use of polyamide resin on the abstraction efficiency were investigated，and the quantitative analysis was conducted on HPLC.And the gradient elution way was optimized.Results showed that，the adsorbing capacity of polyamide was 1 g·g－1resin when the process was as follows：after dissolved with acetic ether，the sample was mixed with polyamide resin，and then the organic solvent was evaporated completely.The loureirin A and B adsorbed by polyamide resin could be gradiently eluted more than 91%by 7 BV of 50%ethanol at the eluting velocity of 0.8 m L·min－1.The process was fit for the abstraction of loureirin A and loureirin B in dragon′s blood with high yield and simple operation.

polyamide resin；abstraction；dragon′s blood；loureirin

TQ 460.6

A

1672－5425（2012）11－0057－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.016

2012－07－16

乐薇（1979－），女，湖北沙市人，硕士，讲师，研究方向：生物分析，E－mail：yuewei11＠126.com。