苯酚对实验红鲫肝脏SOD和GSH-Px活性的影响

梁仕杰 高丽君 董先辉 姚 峰 吴端生▲

1.南华大学药学与生命科学学院，湖南衡阳 421001；2.南华大学实验动物学部，湖南衡阳 421001

苯酚对实验红鲫肝脏SOD和GSH-Px活性的影响

梁仕杰1△高丽君1董先辉1姚 峰2吴端生1▲

1.南华大学药学与生命科学学院，湖南衡阳 421001；2.南华大学实验动物学部，湖南衡阳 421001

目的 研究苯酚对实验红鲫肝脏中SOD和GSH-Px活性的影响。 方法 将40尾实验红鲫随机分为空白对照组、2.16 mg/L、4.31 mg/L、8.60 mg/L、17.24 mg/L苯酚组，每组8尾。在染毒的24、48、72、96 h各组分别取2尾红鲫的肝脏制成匀浆，检测肝脏SOD和GSH-Px活性。 结果 苯酚对实验红鲫的96 h LC50为34.48 mg/L；随着染毒浓度的增高和染毒时间延长，各染毒组红鲫的SOD和GSH-Px的活性与对照组相比均升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 实验红鲫肝脏SOD和GSH-Px的活性与有机污染物苯酚之间存在剂量-反应和时间-效应关系。SOD和GSH-Px可作为生物标志物用于苯酚等有机污染物的监测。

苯酚；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；肝脏；红鲫

苯酚（phenol）又名石碳酸，自1923年世界上采用苯磺化法首次生产苯酚以来，世界苯酚的生产迅速发展。苯酚已成为中国地表水中的第一大类水体污染物，对水生生态环境存在一定的生态风险。如果饮用或者食用污染水域中的水或水产，将直接影响到人体健康，这也是当前社会环保部门优先检测的污染物。苯酚属细胞原浆型毒物，低质量浓度下可造成蛋白变性，高质量浓度时造成蛋白质凝固，为神经性毒剂[1]。其不仅可使污染水域中水生生物急性中毒死亡[2]，而且易在水生生物体内积累和富集，从而危害人类的健康[3]。但目前的大多数研究主要关注其急性毒性[4]，对其效应质量浓度长期作用下可能对水生生物体所引发的相应生化毒性研究不多[5-7]。多数污染物都具有氧化还原活性，能氧化损伤细胞，其机制是生成大量的活性氧自由基的有害产物，干扰生物正常的氧化还原循环[8]。当面临污染胁迫时，机体会出现明显的毒性效应，生物机体内的抗氧化防御酶系的活性也会相应改变，因而能间接反映环境中氧化作用的存在，可作为衡量环境污染胁迫程度的指标[9]。作为一类可反映污染物对细胞氧化损伤程度的分子生态毒理指标，抗氧化防御酶系已逐渐成为了研究热点。而在抗氧化防御酶系中发挥重要作用的是超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peratidase，GSH-Px）[10-16]。为此，本试验选择SOD和GSH-Px作为评价苯酚对鱼体损伤程度的分子生物指标，研究在不同暴露浓度和不同作用时间下，苯酚对红鲫肝脏SOD活性和GSH-Px活性的影响，为环境监测和水环境风险评估提供参考，同时也为进一步了解苯酚毒理机制提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 试验鱼类

试验鱼类为实验红鲫，取自南华大学实验动物学部，体质健康，鱼龄1.5年，平均体长（10.0±0.2） cm，平均体重（45.0±0.5） g，在水族箱内驯养1周后用于实验。养殖水体为曝气3 d的自来水，pH=7.0，水温（23±2）℃。

1.2 急性毒性实验

按静水毒性实验法将实验红鲫暴露于含苯酚浓度为1.204、1.301、1.398、1.505、1.602、1.699、1.799 mg/L 共 7 个染毒组的水簇箱中，每个浓度再设3个平行组，每组饲养8尾，96 h后观察并记录实验鱼中毒与死亡状况，按照参考文献[2]计算出96 h LC50。

1.3 染毒

在急性毒性试验基础上，将实验红鲫分别饲养在5个实验组的水簇箱中。其中设4个染毒组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）含苯酚浓度 分 别 为 96 h LC50 的 1/16、1/8、1/4、1/2，即 2.16、4.31、8.60、17.24 mg/L，另设1个空白对照组不含苯酚。每组饲养实验红鲫8尾，每个浓度设一个平行组。试验期间每天换一半水，并补足苯酚至原来浓度，染毒96 h。

1.4 组织的提取和酶活性的测定

每个染毒组的实验红鲫，分别在染毒12、24、72、96 h后，取2尾鱼解剖，提取肝脏，于生理盐水中漂洗，洗去血液，滤纸吸干多余生理盐水后称重。将肝脏剪碎倒入匀浆器中研磨，每0.003克肝脏组织分别加入约3 mL和0.75 mL的生理盐水制成0.1%和0.4%的肝组织匀浆液，前者用于SOD活性测定，后者用于GSH-Px测定，在4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定。本实验用WST-1法测定试剂盒（购置于南京建成生物工程研究所）测定SOD活性，用GSH-Px试剂盒（购置于南京建成生物工程研究所）测定GSH-Px活性。测试过程参照试剂盒说明书。

1.5 蛋白含量测定

蛋白含量测定使用南京凯基生物科技发展有限公司的BCA蛋白含量测定试剂盒。

1.6 统计学处理

采用SPSS11.5方差分析对染毒组和空白对照组的数据进行比较，分析苯酚对实验红鲫肝脏SOD和GSH-Px活性影响的剂量-效应与时间-效应关系，结果以（± s）表示，显著性水平定为α=0.05，并用t检验法进行相关显著性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度下苯酚对SOD活性的影响

在苯酚暴露实验开始观察实验红鲫的中毒反应，染毒初期出现过分躁动活跃的情况，之后行动越来越缓慢，平衡感受到影响，身体倾斜，个别个体竖立悬浮于水中，并伴有鱼鳞变黑，后期静止在水底鱼尾弯曲，呼吸微弱。苯酚对实验红鲫的96 h LC50为34.48 mg/L。苯酚对实验红鲫肝脏SOD活性影响的剂量-效应和时间-效应关系见表1和图1。其中，SOD活性在2.16、4.31、8.60、17.24 mg/L的苯酚浓度范围内，随着苯酚质量浓度的增大，暴露时间的延长，SOD的活性也随之增大。在染毒组Ⅰ，24 h 的 SOD 活性为（130.48±2.31）U/mgprot，高于空白对照组的127.38 U/mgprot，染毒组Ⅱ和染毒组Ⅲ的酶活性变化不显著，但均高于染毒组Ⅰ。在染毒组Ⅰ和染毒组Ⅱ，48 h 的SOD活性接近，而染毒组Ⅲ与组Ⅳ的酶活性呈现上升的趋势。在染毒组Ⅳ，48 h之前的SOD活性增强缓慢，为（165.94±8.58）U/mgprot，48 h之后的SOD活性迅速增强，至96 h时酶活性呈最大值，为（222.91±6.59）U/mgprot。

图1 苯酚对实验红鲫肝脏SOD活性的影响

2.2 不同浓度下苯酚对GSH-Px活性的影响

苯酚对实验红鲫肝脏GSH-Px活性影响的剂量-效应和时间-效应关系见表2和图2。表2和图2显示，在染毒24 h后，各个染毒组的GSH-Px活性都相对降低，降低的幅度随着苯酚浓度的增大而增大；从24 ～96 h，随着苯酚暴露时间的延长，GSH-Px活性逐渐升高。在染毒24 h后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的GSH-Px 活 性 分 别 为（530.04±6.55）U/g、（522.59±4.34）U/g、（511.66±7.49）U/g、（478.34±5.44）U/g，均低于空白对照组。在染毒96 h后，Ⅳ组的GSH-Px活性值达到最大，为（906.76±4.79）U/g。

表1 苯酚对实验红鲫肝脏SOD活性的影响（ ± s，U/mgprot）

表1 苯酚对实验红鲫肝脏SOD活性的影响（ ± s，U/mgprot）

注：相同时间染毒组与对照组比较，aP＜0.05；不同时间染毒组与对照组比较，bP＜0.05

组别 24 h 48 h 72 h 96 h空白组 126.22±2.25 129.19±2.07 126.91±1.88 127.20±2.24Ⅰ组（2.16 mg/L） 130.48±2.31 144.16±6.15ab 169.47±7.95ab 179.59±8.24abⅡ组（4.31 mg/L） 130.44±4.69 148.31±7.58ab 168.96±6.31ab 173.79±5.72abⅢ组（8.60 mg/L） 141.71±5.39ab 152.50±5.19ab 175.65±7.97ab 183.14±3.98abⅣ组（17.24 mg/L） 150.52±6.59ab 165.94±8.58ab 222.72±4.88ab 222.91±6.59ab

表2 苯酚对实验红鲫肝脏GSH-Px活性的影响（± s，U/g）

表2 苯酚对实验红鲫肝脏GSH-Px活性的影响（± s，U/g）

注：相同时间染毒组与对照组比较，aP＜0.05；不同时间染毒组与对照组比较，bP＜0.05

组别 24 h 48 h 72 h 96 h空白组 547.61±2.46 550.38±3.02 549.35±2.32 547.14±2.69Ⅰ组（2.16mg/L） 530.04±6.55ab 534.09±6.81ab 614.02±4.97ab 627.03±7.36abⅡ组（4.31mg/L） 522.59±4.34ab 593.76±4.99ab 647.24±6.57ab 688.79±5.08abⅢ组（8.60mg/L） 511.66±7.49ab 629.64±8.40ab 749.43±7.60ab 810.43±5.60abⅣ组（17.24mg/L） 478.34±5.44ab 675.34±6.37ab 831.77±6.54ab 906.76±4.79ab

图2 苯酚对实验红鲫肝脏GSH-Px活性的影响

3 讨论

SOD和GSH-Px活性的高低与动物的抗逆性之间有一定的相关性，抗氧化酶活性的变化与环境中被污染的强度也具有相关性。在其耐受度内，SOD和GSH-Px的活性会随着污染强度的增加而增强[17-18]，随活性氧自由基的增多而被诱导增加，抗氧化防御系统打开，刺激了SOD和GSH-PX等酶的合成，是生物对污染的适应性反应[19-20]。在正常生理条件下，机体内的SOD和GSH-Px的合成量能满足清除活性氧自由基的需要，但在疾病或者衰老的情况下，氧自由基的生成与清除则会失衡[21]，氧自由基可导致DNA断裂、脂质过氧化、酶蛋白失活等毒性损伤。本实验中，苯酚污染对实验红鲫肝脏SOD和GSH-Px的合成表现出了显著的诱导作用（P＜0.01）,在96 h以内，苯酚浓度低于17.24 mg/L的情况下，SOD的活性随着苯酚的浓度的增加而增加。说明96 h的污染物暴露时间内，17.24 mg/L还没达到实验红鲫对苯酚污染的适应性反应到中毒反应的阈值，此时肝组织产生的活性氧能被及时清除。GSH-Px表现为在染毒后24 h后活性有所下降，在苯酚暴露初期，可能GSH-Px敏感性较SOD低，氧自由基在肝脏中有一定的积累，但尚未对GSHPx酶活性产生诱导，主要由SOD清除氧自由基，所以结果显示GSH-Px活性下降，而SOD活性升高；随着暴露时间延续，积累的氧自由基对酶产生了诱导作用，使GSH-Px活力代偿性增强以清除体内产生的氧自由基。有相关文献研究剑尾鱼和斑马鱼等的同类的实验，实验结果与本实验符合，由此得出实验红鲫可以作为水源中一种优良的安全指示生物。另外，两种酶活性的变化表现出极大的相关性，更加证明SOD和GSH-Px在抗氧化酶系统中是协同作用的关系。

苯酚是常见的工业化工原料，也是水体中常见的有毒物质，水中浓度过高会危害水生生物，同时也会污染周边环境从而危害人们的健康。通过本实验可以看出苯酚对动物的毒害程度，表明它对水生生态系统具有不可忽视的直接和潜在危害。从图1和图2中可以看出，实验红鲫肝组织中SOD和GSH-Px对苯酚浓度的变化极为敏感，极低浓度就能引起酶活性迅速发生改变，且变化程度与苯酚的浓度密切相关。作为敏感的分子生态毒理学指标，SOD和GSH-Px活性的检测有望应用于水域环境苯酚污染的预警。同时，笔者应该重视周围环境的保护，严格控制工业废水的排放量，减少有毒有害物质对水资源的污染，创造一个具有良好生态体系的淡水环境。

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Effects of phenol on the activity of SOD and GSH-Px in red crucian carp liver

LIANG Shijie1GAO Lijun1DONG Xianhui1YAO Feng2WU Duansheng1
1.College of Pharmacy and Life Science of Nanhua University,Hengyang 421001,China;2.Department of Laboratory Animal of Nanhua University,Hengyang 421001,China

ObjectiveTo investigate the effects of phenol on the activites of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in red crucian carp liver.MethodsForty carassius auratus red variety were randomly and averagedly divided into one control group and four phenol groups:0,2.16 mg/L,4.31 mg/L, 8.60 mg/L,17.24 mg/L.The activities of SOD and GSHPx in liver of two carassius auratus red variety per group were respectively detected after 24 h,48 h,72 h,96 h.ResultsLC50 of phenol for 96 h was 34.48 mg/L in carassius auratus red variety.Compare to the control group,the activites of SOD and GSH-Px in liver of phenol groups were lower,and they increased with the dose increased,the differences were significant(P＜0.05).ConclusionThere was dose-response and time-response relationship between phenol and the activities of SOD and GSH-Px.The activities of SOD and GSH-Px can become biological marker which were used to detect the organic contaminants,phenol for example.

Phenol;Superoxide dismutase;Glutathione peroxidase;Liver;Carassius auratus red variety

R-332

A

2095-0616（2012）07-31-04

湖南省科研条件创新专项基金（2010TT1007）。△南华大学生物化学与分子生物学2009级在读硕士研究生▲

2012-02-27）