恩施州部分伤寒沙门氏菌分离鉴定和基因分型结果分析

刘继华 杨继先 解书润 吴小凤

湖北省恩施土家族苗族自治州疾病预防控制中心，湖北恩施 445000

恩施州部分伤寒沙门氏菌分离鉴定和基因分型结果分析

刘继华 杨继先 解书润 吴小凤

湖北省恩施土家族苗族自治州疾病预防控制中心，湖北恩施 445000

目的 对两起由伤寒沙门氏菌引起的聚集性爆发流行中所分离到的伤寒沙门氏菌进行鉴定和基因分型，探讨恩施州伤寒沙门菌的分子流行病学，为科学防治提供依据。 方法 用传统方法对11株伤寒沙门氏菌菌株进行生化、血清学复核鉴定。对确认的伤寒沙门氏菌菌株，采用脉冲场凝胶电泳技术分析电泳酶切指纹图谱。 结果 11株伤寒沙门菌经PFGE，根据其条带的差异可分为3个PFGE型别。 结论 两起伤寒沙门氏菌感染为不同亚型所致。

脉冲场凝胶电泳；伤寒沙门氏菌；基因分型

2010年12月～2011年4月，恩施州两所中学连续发生两起经证实由伤寒沙门氏菌引起的聚集性爆发流行。基本比对方法在传染病病原追踪研究中证实了其实用性和科学性，并在霍乱弧菌毒力基因和基因分型研究中取得了可证实的作用[1]。为了解这两起伤寒沙门氏菌引起的疫情的内在联系，在湖北省预防科学院有关专家的支持下，采用脉冲场电泳基因分离检测技术对两起疫情的病原进行基因比对，以确定两起情是否有同源性，以利于伤寒病流行病学监测与控制。现将检测结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

采用两起由伤寒沙门氏菌引起的聚集性爆发流行中所分离到的伤寒沙门氏菌共 11 株。其中；NS-1、2、3、4、5、6、8、9、10、11号为同一起事件分离的菌株；NS-7为另一起事件分离的菌株。

1.2 仪器与试剂

ATB半自动细菌鉴定仪、VITEK 2-COMPCT、VITEK2G细菌鉴定卡均由法国生物梅里埃公司生产：脉冲场电泳检测的仪器及试剂由中国疾控中心实验室提供并在此完成实验检测。细菌培养所需培养基均由北京陆桥生物技术有限公司生产：沙门氏菌诊断血清（30种）由兰州生物制品研究所提供，均在有效期内使用。

1.3 菌株血清型别及生化反应

对11株菌株用ATB半自动细菌鉴定仪进行生化鉴定确定其沙门菌属后，再按GB/T4789.4-2003用沙门菌分型血清进行分型。

1.4 DNA指纹图谱分型（PFGE）方法

1.4.1 凝胶制备 取1 mL细胞悬浊液（CSB）置于编号的离心管内，并设空白对照，用CSB湿润接种环刮取适量细菌，放入CSB的管中，使其悬浊，比浊度A值为4.2，同时设立空白对照管。取400 μL菌悬液移入1.5 mL tppendorf离心管中，37℃ 水浴5 min，加入 20 μL蛋白酶K（储存液浓度为20 mg/mL），充分混匀，加入400 μL 2%低熔点琼脂糖凝胶，轻轻混匀，倒入凝胶模具，在室温下10～15 min放置成胶块。

1.4.2 细胞裂解 移取5 mL细胞裂解液于50 mL离心管中，加入 25 μL蛋白酶 K（20 mg/mL），充分混匀，放入凝胶，水浴摇床加热（54℃，170 r/min，2 h）后倒弃洗液，然后吸取15 mL缓冲液TE（预热至50℃），震荡到凝胶浮于液体中，水浴摇床50℃，10 min，弃去缓冲液TE，重复此过程3次。最后加入10 mL缓冲液TE，放入4℃环境中备用。

1.4.3 胶块内DNA的酶切 切1～3 mm胶块，浸入150 μL酶切体系中（其中含XbaⅠ酶50 U），37℃ 3 h以上或过夜。

1.4.4 加样 将酶切后的凝胶粘于样10齿样品梳齿，加标准菌株H9812于1.5.9孔上，吸干凝胶块附近液体，室温下风干

3 min，移齿梳入胶槽，倒入100 mL 1%低熔点琼脂糖（SKG）（55～60℃平衡），室温下放置30 min。

1.4.5 电泳 取凝固好的胶，放入电泳槽，根据不同限制性内切酶设置电泳参数设置电流参数，电泳15 h。SfiⅠ酶酶切参数：50 U，37℃电泳参数2～10 s，线形条件，电泳时间18 h，电泳温度14℃。

1.4.6 染色及读胶 从电泳槽中取出胶块放入400 mL溴化乙啶（EB）溶液的托盘内，置摇床30 min（EB染色），加入500 mL纯水，脱色60 min。取出置凝胶成像系统设备内分析。

2 结果

2.1 生物学性状

11株细菌经VITEK细菌鉴定系统鉴定，生化试验均符合沙门菌属，血清型鉴定结果：11份菌株均与A-F群多价、O-9群、Vi、H-d沙门氏菌标准血清凝集，盐水不凝。鉴定为伤寒沙门氏菌。

2.2 PFGE指纹图谱

将两起分离得伤寒沙门氏菌株11株，经XbaⅠ酶切PFGE电泳后，根据电泳带的不同，可分为3个型别，每个菌株产生13～15条电泳带，大小在20～600 kb。其中NS-4、NS-8号菌株条带相同，NS-7号菌株在668.0～452.7 kb之间及173.4 kb左右个缺少1条条带，在398.4～452.7 kb之间则出现1条条带。其余 NS-1、2、3、5、6、9、10、11 号菌株的电泳条带完全一致。见图1。

图1 11株伤寒沙门氏菌PFGE电泳图谱

3 讨论

本研究采用脉冲场电泳分离技术，用XbaⅠ酶切伤寒沙门氏菌的DNA，经电泳后均得到清晰的电泳图谱。所有菌株的基因组均能被限制性内切酶XbaⅠ有效地进行酶切，均获得30.0～668.9 kb的13～15条条带。从图谱中可明显地分出3种PFGE图谱，即分为3种PFGE型。可以看被检测菌株的脉冲场电泳图谱有明显差异，H9872标准菌株在凝胶不同的位置所产生的电泳图谱一致性较好，表明凝胶电泳精确性较好，可对图谱进行分析。NS-1、2、3、4、5、6、8、9、10、11 菌株来源于同一疫情样品，其图谱一致性较好。NS-7菌株是另一起疫情样品，其产生的图谱明显与前述样品不一致，说明其差异是由于其本身基因差异引起。提示它们并不是一个克隆系，而是以多克隆系存在，说明两起伤寒沙门氏菌感染为不同基因型所致。

PFGE分型技术是传统的DNA琼脂糖凝胶电泳的发展，PFGE具有分辨力高，重复性好的特点。已在沙门氏菌、霍乱弧菌等细菌分型中得到广泛应用，被认为是细菌分子流行病学研究的“金标准 ”[2-3]。运用脉冲场电泳分离技术，根据源性不同的菌株有不同的电泳图谱，分析细菌不同血清型的基因组差异，有助于分析追踪疫情与来源。本研究两起疫情发生地相距约60公里，属不同县级行政区划，两地人员物资交流较频繁，多年来两地由伤寒沙门氏菌引起疾病处于相对较高发病水平，追踪其传染源是制定对于两地此类疾病疫情监测与控制策略的重要前提，此次两起疫情的不同源性，提示其各自有相对独立的传染源。运用脉冲电泳技术建立与完善恩施州伤寒沙门氏菌电泳图谱，可以为以后同样疫情提供重要的参考。

[1] 程均福，王鸣，冯宇良，等.湖北省部分霍乱弧菌毒力基因和基因分型结果分析 [J].职业与健康，2009，25（18）：1909-1911.

[2] 金春光，徐景野，章丹阳.伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳分型方法研究[J].中国卫生检验杂志，2005，l5（10）：1972-1973.

[3] 丁建清，董杰，王书梅，等.脉冲场电泳在霍乱弧菌分型中的应用[J].中国卫生检验杂志，2005，15（7）：97，197.

Result analysis of isolating,identificating and genotyping of salmonella typhi in parts of Enshi autonomous prefecture

LIU Jihua YANG Jixian XIE Shurun WU Xiaofeng
Enshi Autonomous Prefecture Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000,China

ObjectiveTo explore and discuss the molecular epidemiology of salmonella typhi in Enshi autonomous prefecture by identification and genotypic of the salmonella typhi which isolated from two cases of aggregative epidemic outbreaks and so to provide a basis for the scientific prevention and cure.MethodsUsing traditional methods to treat 11 bacterial strains of salmonella typhi by biochemical and serological review expert. For confirmed bacterial strains of salmonella typhi, we use pulsed field gel electrophoresis technology to analyse the fingerprints of PFGE.ResultsBy the experiment of PFGE ,11 bacterial strains of salmonella typhi can be divided into 3 types according to the discrepancy of bands.ConclusionTwo cases of salmonella typhi infection are caused by different hypotypes.

Pulsed field gel electrophoresis;Salmonella typhi;Genotyping

R733.3

A

2095-0616（2012）11-92-02

2012-03-09）