注射用头孢呋辛钠无菌检查的方法学验证

李夏林 覃 晓

广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西桂林 541002

注射用头孢呋辛钠无菌检查的方法学验证

李夏林 覃 晓

广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西桂林 541002

目的建立注射用头孢呋辛钠的无菌检查方法。方法按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ H“无菌检查法”项下的要求，采用薄膜过滤法，接种至含有头孢菌素酶的培养基中进行试验。结果方法验证试验的供试品试验管和阳性对照管中的试验菌均生长良好。结论本法能满足注射用头孢呋辛钠无菌检查的方法学要求。[关键词]方法学验证；注射用头孢呋辛钠；无菌检查

头孢呋辛钠属β-内酰胺类抗生素中的头孢菌素类，对革兰阳性球菌和部分革兰阴性杆菌均敏感。可用于敏感菌所致的呼吸道感染、耳、鼻、喉科感染、泌尿道感染、皮肤和软组织感染、骨和关节感染、产科和妇科感染、淋病等[1]。根据《中国药典》的要求，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查[2]。现将注射用头孢呋辛钠的无菌检查方法建立报道如下。

1 仪器与材料

HTY-2000A集菌仪、KDGB220和KDGB330集菌培养器，杭州高得医疗器械有限公司生产。验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501]、生孢梭菌 [CMCC（B）64941]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉菌 [CMCC（F）98003]，均来自中国医学细菌保藏中心，均为第3代。硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，均为北京三药科技开发公司生产。头孢菌素酶冻干粉（500万U/支）杭州北望生物技术有限公司生产。注射用头孢呋辛为国内药厂生产，规格为0.75 g。

2 实验方法

2.1 菌液制备

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，分别于30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48 h。分别取上述培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释成50～100 cfu/mL的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃培养5～7 d，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 mL洗脱孢子，将孢子液移至比浊管中，于细菌标准比浊管进行比较，取1 mL孢子原液用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释成含孢子数50～100 cfu/mL的孢子悬液。各菌液计数结果见表1。

2.2 方法验证

取供试品6瓶用0.9%无菌氯化钠溶液90 mL溶解，混匀，于集菌仪上通过一副KDGB220集菌培养器中的一联滤筒中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100 mL，共5次，在最后一次冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌，过滤，然后泵入100 mL培养基，并加入约500万U的头孢菌素酶。在另一滤筒中泵入100 mL培养基，并加入等量的试验菌，作为阳性对照。每种试验菌及相应的培养基同法逐一处理。另取一副KDGB220集菌培养器，分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基至两个滤筒中，作为阴性对照。上述集菌培养器分别置规定温度培养3～5 d。见表2。

表2 注射用头孢呋辛钠无菌检查验证实验结果

2.3 供试品测定

取供试品9瓶，用0.9%无菌氯化钠溶液140 mL溶解，混匀，于集菌仪上通过一副KDGB330集菌培养器中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次300 mL，共5次，在其中两管泵入各100 mL硫乙醇酸盐流体培养基（其中一管接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌作为阳性对照），另一管泵入100 mL的改良马丁培养基，并在每管中加入约500万U的头孢菌素酶。另取一副KDGB220集菌培养器，取上述溶剂和冲洗液同法操作，分并别泵入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，作为阴性对照。将集菌培养器分别按规定温度培养14 d，逐日观察并记录，结果供试品管和阴性对照管均澄清，阳性对照管在48 h内菌生长良好，本实验结果成立。

表1 细菌和真菌计数结果（菌数为2个平皿的平均数，cfu/mL）

3 讨论

头孢呋辛钠为头孢菌素类广谱抗生素，对敏感菌有较强的抗菌活性，故在该品种的无菌检查时，应采取适当的方法消除和破坏其抗菌活性。作者在摸索该品种薄膜过滤法实验条件时，在相同样品量的情况下，曾采取仅用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗的方式，供试品试验管在规定时间内有试验菌生长微弱、缓慢或不生长的情况。而采取用含适量头孢菌素酶的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗的方式，也存在某些供试品试验管的试验菌在规定时间内生长微弱、缓慢的情况，说明这两种方法均不能有效消除头孢呋辛钠的抗菌活性。只有采取本文中将适量头孢菌素酶加入培养基的方法，使酶与药品能充分地接触，酶解作用完全，得以有效地灭活滤器中残留头孢呋辛钠的抗菌活性，而且所需冲洗液的量和冲洗次数也较合适，从而确认头孢呋辛钠在本文试验条件下方法的可靠性，可以保证检验结果的准确可靠。

[1]国家药典委员会.临床用药须知：化学药和生物制品卷（2010年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2011：650.

[2]国家药典委员会.中国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录104.

R917

B

2095-0616（2012）11-88-02

2012-04-26）