高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件与酶学性质

庞宗文，郭法谋，徐 勇，梁静娟，彭 幸，陆 薇

（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）

高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件与酶学性质

庞宗文，郭法谋，徐 勇，梁静娟，彭 幸，陆 薇

（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）

以本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌QS7-2-4为生产菌种，进行固体发酵产木聚糖酶的发酵条件研究，结果表明最佳产酶条件为：玉米芯∶麸皮为7∶3（w/w）；最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量为1.5%；吐温-80添加量为0.5%，初始pH为7.2，培养基含水量为80%，250mL三角瓶装料量为8g，发酵温度50℃，发酵时间72h，该条件下木聚糖酶产量达27952U/g干基。该酶最适反应温度为75℃，最适反应pH为4.5，在70℃以下具有良好的稳定性，在室温下储藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶，固体发酵，嗜热子囊菌

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4从广西各地采集的土样中分离筛选并鉴定，保藏在本实验室；玉米芯、甘蔗渣、玉米秸秆、稻草 取自农田，经干燥粉碎后过40目筛备用；麸皮 购自农贸市场；桦木木聚糖和木糖 Sigma公司，纯度大于99%；其他试剂 均为国产分析纯；PDA平板培养基 去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然；固体发酵培养基 称取8g碳源于250mL三角瓶中，加入32mL营养盐溶液，pH自然，121℃灭菌30min；营养盐溶液（g/L） K2HPO42.4，（NH4）2SO41.5，KH2PO41.0，CaCl20.3，MgSO40.3，尿素0.7，酵母浸膏4.8，吐温-80 1.7，微量元素液1.0mL，蒸馏水充分溶解，现配现用；微量元素液（g/L） ZnSO41.4，MnSO41.6，CoCl22.0，FeSO42.5，用蒸馏水充分溶解。

1.2 实验方法

1.2.1 固体发酵和粗酶液的制备 将保藏的菌种接种到PDA平板上，50℃培养96h进行活化。挑取3环菌丝接种到固体发酵培养基中，混匀后置50℃培养96h。称取湿曲5g于干燥三角瓶中，加入150mL的0.05mol/L pH4.8的柠檬酸缓冲溶液，置180r/min的摇床上室温浸提2h，4℃冷冻离心（12000r/min，10min），上清液即为木聚糖酶粗酶液。同时称取湿曲5g放入干燥培养皿中，放入100℃烘箱中烘干至恒重。

1.2.2 固体发酵产酶条件的优化 在250mL三角瓶中分别考察不同的碳源、氮源、装料量、含水量、培养基初始pH、发酵温度、发酵时间、吐温-80添加量等因素对产酶的影响。

1.2.3 木聚糖酶的酶学性质初探 分别考察粗酶液中木聚糖酶的最佳反应温度、最佳反应pH以及温度稳定性、pH稳定性和储藏稳定性。

1.2.4 木聚糖酶活力的测定 酶活测定采用DNS法：将0.1mL适当稀释的粗酶液加入到15mL的具塞试管中，加入1%（w/v）用pH4.8的柠檬酸缓冲溶液配制的桦木木聚糖溶液0.9mL，70℃反应10min。冰浴迅速冷却，加入1.5mL DNS试剂，充分混匀后置沸水浴中煮沸5min，迅速用冷水冷却至室温，于540nm下测定产生的还原糖量，用灭活酶液作空白对照。酶活力定义：在70℃、pH4.8条件下，每分钟生成1μmol木糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 产木聚糖酶发酵条件优化

图1 不同单一碳源对菌株QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.1 Effect of carbon source on xylanase production of QS7-2-4

2.1.1 不同碳源对产木聚糖酶的影响 采用麸皮、玉米芯、玉米杆、稻草秸秆、花生壳、木薯渣、木薯杆渣为单一碳源进行固体发酵产酶实验，结果如图1所示。图1结果表明，以麸皮、玉米芯为碳源时木聚糖酶产量较高，分别达到12956U/g干基和9876U/g干基。以麸皮、玉米芯为主要原料进行复合碳源实验，结果如图2所示。由图2可知当玉米芯∶麸皮为7∶3时木聚糖酶活力最高，达到16437U/g干基，比单一碳源有较大幅度提高，以下所作发酵条件均以玉米芯∶麸皮（7∶3）作为碳源。

图2 玉米芯与麸皮的不同比例对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.2 Effect of different ratio of corncob to wheat bran on xylanase production of QS7-2-4

2.1.2 不同氮源对发酵产木聚糖酶的影响 以玉米芯∶麸皮（7∶3）作为碳源，去除营养盐溶液中的氮源，分别添加不同的氮源，考察不同氮源对发酵产木聚糖酶的影响，氮源的添加量以碳源量为基准计算。实验结果如表1所示。表1实验结果表明有机氮源普遍好于无机氮源，在无机氮源中以添加1.0%（NH4）2SO4的培养基产酶水平最高，达到17020.51U/g干基，在有机氮源中以酵母浸膏和胰蛋白胨混合氮源时产酶活性最高，达到23169.23U/g干基。另外，在选用廉价的农副产品花生麸和豆粕作为氮源时也取得了良好的效果，添加5%花生麸木聚糖酶活力达到18844.87U/g干基，添加8%豆粕木聚糖酶活力可达到19120.88U/g干基，这一实验结果将为工业化生产提供重要的参考。

表1 不同氮源对发酵QS7-2-4产木聚糖酶的影响Table 1 Effect of nitrogen sources on fermentation of QS7-2-4 xylanase production

2.1.3 三角瓶装料量对产木聚糖酶的影响 装料量对木聚糖酶产量的影响如图3所示，在较少的装料量情况下，水分散失较快，菌体生长受到影响，木聚糖酶产量较低。在较多的装料量的情况下，固体曲内部散热及氧传递困难，故木聚糖酶产量也较低。实验表明，在250mL三角瓶中，最佳装料量为8g，此时木聚糖酶产量可达22161U/g干基。

图3 培养基装料量对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.3 Effect of the amount of medium in 250mL flask on xylanase production of QS7-2-4

2.1.4 发酵温度对产木聚糖酶的影响 将固体发酵培养基分别在35、40、45、50、55、60℃下培养4d，考察发酵温度对产木聚糖酶的影响，结果如图4所示。QS7-2-4在50℃下发酵其产木聚糖酶能力最强，发酵4d木聚糖酶活力可达24233U/g干基。菌体在35、40、45℃发酵时生长缓慢，当发酵至84h时，菌体才刚长满培养基。而在55℃发酵时，菌体能较快生长，但过早衰老，且培养基的水分散失较快，不利于产酶。在60℃培养时，只有少量菌体生长且很快衰老，水分散失很快。QS7-2-4的最佳发酵温度为50℃。

图4 发酵温度对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.4 Effect of temperature on xylanase production of QS7-2-4

图5 培养基初始pH对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.5 Effect of initial medium pH on xylanase production of QS7-2-4

2.1.5 培养基初始pH对产木聚糖酶的影响 将营养盐溶液调至不同的pH，并以此pH不同的营养盐溶液配制固体发酵培养基。接种后在50℃恒温培养箱中培养4d，测定木聚糖酶活力，结果如图5所示。从图5可以看出初始pH对木聚糖酶的产量影响不显著，因初始营养盐溶液的pH为7.2，因此QS7-2-4发酵木聚糖酶的pH为7.2。

2.1.6 发酵时间对产木聚糖酶的影响 固体发酵于50℃下进行，每隔6h取样测定酶活，QS7-2-4产木聚糖酶的时间过程如图6所示。当发酵至48h时，发酵基质中长满菌体，木聚糖酶活力也迅速升高。之后菌体量不再明显增加，主要为产酶阶段，当发酵至72h时，酶活力达到22948U/g干基，之后酶活力基本稳定。因此QS7-2-4产木聚糖酶的最适时间为72h，这是目前国内耐热木聚糖酶发酵时间最短的菌株，其他报道的菌株大部分需要5~7d或需要更长时间。

图6 发酵时间对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.6 Effect of fermentation time on xylanase production of QS7-2-4

2.1.7 吐温-80添加量对产木聚糖酶的影响 在固体培养基中分别添加不同量的吐温-80，置50℃培养箱中发酵72h，测定木聚糖酶活力，结果如图7所示。吐温-80是一种表面活性剂，可促进细胞产生的木聚糖酶释放至细胞外，降低木聚糖酶的阻遏作用，提高木聚糖酶产量。当吐温-80的添加量从0.1%增至0.5%时，木聚糖酶产量随之提高；添加量为0.5%～1.1%时酶产量稳定；但过高含量的吐温-80又对细胞产生毒害作用，当吐温-80添加量大于1.1%时，木聚糖酶产量降低。从酶活力与经济角度考虑，吐温-80最适添加量为0.5%。

图7 吐温-80添加量对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.7 Effect of Tween-80 content on xylanase production of QS7-2-4

2.1.8 固体曲含水量对产木聚糖酶的影响 固体曲含水量对产酶的影响如图8所示。含水量对固体曲发酵产酶影响显著，含水量过高或过低都不利于营养物的利用、菌体的生长及酶的产生。含水量过低时，菌体生长缓慢且水分蒸发较快，使菌体因缺水而造成代谢缓慢甚至停止，造成产酶量较低。含水量过高时则会引起培养基粘结，使氧传递困难、培养基内部溶氧不足，使菌体生长繁殖缓慢，而且容易造成烧曲，从而影响酶产量。因此需要使培养基的含水量适度，从图8可以看出最佳含水量为80%，此时菌体产酶达到最大值27952U/g干基。

图8 固体曲含水量对QS7-2-4产木聚糖酶的影响Fig.8 Effect of water content in solid medium on xylanase production of QS7-2-4

2.2 QS7-2-4木聚糖酶酶学性质

2.2.1 木聚糖酶的最适反应温度 分别在不同的反应温度下测定粗酶液中的木聚糖酶活力，结果如图9所示。当反应温度从40℃上升到75℃时，木聚糖酶活力随温度升高显著增强，75℃时酶活力达到最大值24032U/g干基，且酶活在70～80℃之间差异不大。当反应温度超过80℃时，酶活力迅速下降。因此QS7-2-4木聚糖酶的最适反应温度为70～80℃。

图9 温度对QS7-2-4木聚糖酶活力的影响Fig.9 Effect of temperature on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.2 木聚糖酶的最适反应pH 分别在不同pH的缓冲液下测定粗酶液中的木聚糖酶活力，结果如图10所示。从图10可知，pH对QS7-2-4木聚糖酶的酶活力影响比较显著，最适pH范围也比较窄，为4.5，当pH大于6.5或低于4.0时，酶活力迅速降低。在pH为4.5~ 5.5范围内，该木聚糖酶有较高的酶活力。

图10 pH对QS7-2-4木聚糖酶活性的影响Fig.10 Effect of pH on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.3 木聚糖酶的热稳定性 在pH4.8的柠檬酸钠缓冲液中，将酶液分别在30、40、50、60、70、80℃恒温水浴锅中保温1h，然后在70℃下测定其木聚糖酶活，结果如图11所示。从图11可知，在40～60℃条件下保温1h木聚糖酶的酶活力基本不变，在70℃条件下保温1h木聚糖酶的残余酶活力为88.41%，而在80℃下保温酶活力迅速降低，保温1h后残余酶活力只有5.84%。说明该木聚糖酶在70℃以下稳定，温度高于70℃将破坏该酶蛋白的空间结构，使该酶失去活性。

图11 温度对QS7-2-4木聚糖酶稳定性的影响Fig.11 Effect of temperature on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.4 木聚糖酶的pH稳定性 分别将木聚糖酶的粗酶液调至不同的pH，室温放置60min，然后在pH4.8、70℃条件下测定残余的木聚糖酶活力。以原始粗酶液（pH4.8）的酶活力为100%，计算相对酶活，结果如图12所示。从图中可以看出，该木聚糖酶在pH4.5～5.5之间比较稳定，放置60min后残余的木聚糖酶活力都在95%以上，pH低于4.0或高于6.0均导致该木聚糖酶的快速失活。

图12 pH对QS7-2-4木聚糖酶稳定性的影响Fig.12 Effect of pH on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.5 木聚糖酶的储藏稳定性 在木聚糖酶的粗酶液（pH4.8）中加入适量的防腐剂，分别在室温和4℃冰箱中放置，定期取样测定木聚糖酶的酶活，结果如图13所示。从图中可以看出，该木聚糖酶具有良好的储藏稳定性，在室温下放置150d还能保持87%的活性。

图13 储藏时间对QS7-2-4木聚糖酶稳定性的影响Fig.13 Effect of stored time on xylanase stability of QS7-2-4

3 结论与讨论

本研究从自然界土壤样品中筛选到一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4，其固体发酵产木聚糖酶的最佳条件为：玉米芯∶麸皮为7∶3（w/w）；最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量为1.5%；吐温-80添加量为0.5%，初始pH为7.2，培养基含水量为80%，250mL三角瓶装料量为8g，发酵温度50℃，发酵时间72h，该条件下木聚糖酶产量达27952U/g干基。该酶的最适反应温度为75℃，最适反应pH为4.5，在70℃以下具有良好的稳定性，在室温下储藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶在饲料加工、造纸漂白、面包改良及啤酒和果汁的澄清中有广泛的应用，目前市场上的木聚糖酶绝大多数是中低温木聚糖酶，其最适酶反应温度为50℃，热稳定性较差，通常超过60℃活性基本丧失，难以满足某些工业应用过程要求。如在啤酒制造过程中，木聚糖酶通常在大麦液化和糖化工段加入，此时的料温一般为70～80℃左右，传统的中低温木聚糖酶在此温度下很快就失去其活性，不适合用于啤酒行业。而本研究所获得的木聚糖酶的最适反应温度为75℃，具有良好的温度稳定性，非常适合于啤酒生产过程的澄清工艺，是一种很有工业化生产应用前景的木聚糖酶。

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Optimization of xylanase production conditions by Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 in solid state fermentation and the properties of xylanase

PANG Zong-wen，GUO Fa-mou，XU Yong，LIANG Jing-juan，PENG Xing，LU Wei
（College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China）

The conditions in solid fermentation of a strain of Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 with high yield of xylanase were studied.The research results indicated that the optimum fermentation conditions were：corncob：wheat bran was 7∶3（w/w），the initial pH was 7.2，the water content of medium was 80%，the feeding amount in 250mL flask was 8g，fermentation temperature was 50℃，fermentation time was 72h，the amount of Tween-80 was 0.5%，the best nitrogen source was 1.5%of peptone.The activity of xylanase under the optimum fermentation condition reached 27952U/g.The optimum temperature and pH of this xylanase were 75℃ and 4.5，respectively.The xylanase was stable when the temperature was below 70℃.The activity of xylanase remained 87%after stored for 150d at room temperature.

xylanase；solid state fermentation；Thermoascus aurantiacus

TS201.3

A

1002-0306（2012）03-0170-05

木聚糖是植物半纤维素的主要组分，在自然界中含量仅次于纤维素，主链由木糖残基以β-1，4糖苷键连接而成，木聚糖的降解对于植物资源的利用具有重要的意义。水解木聚糖的酶主要是内切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶，β-1，4木聚糖酶是一类以内切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键的酶类，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶[1-2]。近年来，木聚糖酶在饲料、造纸、食品加工及燃料乙醇生产等行业都有广泛的应用。如在制浆造纸工业中用于纸浆的生物漂白，在食品工业中用于功能性低聚木糖制造、面团改良剂以及改善啤酒工业的麦汁和啤酒的过滤澄清等，在饲料工业中作为饲料添加剂可有效分解饲料中的抗营养因子[2-8]。由于木聚糖酶在许多工业应用过程中常需要在高温下进行操作，因此对耐热木聚糖酶的研究开发已引起了国内外学者的高度重视，在以嗜热真菌生产耐热木聚糖酶的研究与开发方面已经取得了一些有工业化生产价值的研究成果[9-12]。本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌Thermoascus aurantiacus QS7-2-4，本文主要研究该菌固体发酵产木聚糖酶的发酵工艺条件，并对其产生的木聚糖酶的酶学性质进行了初步的研究，为耐热木聚糖酶的工业化生产及应用提供科学依据。

2011－05－09

庞宗文（1984-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶学及生物质能源。