黄芩苷对人肺腺癌A549细胞的抑制作用及相关机制

郑海峰，王英妹，武铁军，李庆祥，张 健，段国辰

（1.邢台市第三医院胸外科，河北 邢台 054000；2.邢台市第三医院神经内科，河北 邢台 054000；3.河北省人民医院胸外科，河北 石家庄 050051）

常用的化疗药物虽然具有抑制肿瘤细胞的作用，但毒副作用也相对较大，长期使用易产生耐药性。目前抗癌药物的研究已逐渐转向天然动植物，我国传统的中医中药已越来越受到人们的青睐，中医中药治疗肿瘤已成为肿瘤治疗领域的一大特色。黄芩苷 (baicalin)是一种黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分，具有抗氧化、诱导干细胞分化、神经保护、抗血管增殖、抗菌等药理作用［1-5］。有研究表明，黄芩苷能够抑制黏液表皮样癌肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤作用［6］。本研究观察了黄芩苷体外对肺腺癌细胞株A549凋亡相关因子表达的影响，探讨黄芩苷是否具有抑制A549细胞的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 肺腺癌A549细胞株细胞购自中国科学院上海细胞研究所；黄芩苷购自南京青泽医药公司，纯度:99.1%；Trizol购自Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI 1640培养液和胰蛋白酶购自美国 Gibco公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 肺腺癌A549细胞株培养于RPMI 1640培养液，含10%小牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，置37℃、CO2孵箱内培养传代。

1.2.2 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期的肺腺癌细胞A549，按1×104/孔接种于96孔板内。以倍比稀释的方法由高到低分别加入不同浓度的黄芩苷 (10、5、2.5、1.25、0.625、0 mg/L)，药物分别作用24、48、72 h，加入MTT(每孔终质量浓度为0.5 g/L)，继续培养4 h后，吸去上清液，加入二甲基亚砜 (DMSO)100 μL，振荡，充分溶解后，用酶标仪490 nm波长下测定各孔OD值，按下述公式计算细胞生长抑制率。抑制率%=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。每组6个复孔，实验重复3次。SPSS 11.5统计软件计算细胞生长抑制50%的药物浓度 (IC50)值及10%的药物抑制浓度 (IC10)值。

1.2.3 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达 实验分2组:对照组 (培养液)、黄芩苷 (1.22 mg/L)作用组，作用24 h后，Trizol一步法提取细胞总RNA，以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并以紫外分光光度法测定RNA的纯度及含量。按照试剂盒说明书，各样品分别取2 μg RNA用于逆转录。每样品分别取1 μL逆转录产物建立PCR反应体系。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)作为内参照基因。PCR反应参数为:95℃5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行30个循环；72℃延伸反应10 min。引物序列如下:Caspase-3:上游5'-GGACAACAACGAAACCTCCG-3'，下游5'-CTCCACTGGTATCTTCTGGCA-3'，PCR片段为568 bp；Bcl-2:上游5'-AGAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，下游5'-TCAAA GAAGGC CACAATCCTC-3'，PCR片段为373 bp；Bax:5'-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3'，5'-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3'，PCR片段为337 bp；内参照GAPDH:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下 游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，PCR片段为452 bp。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪进行DNA电泳条带分析，以目的基因与GAPDH的光密度比值表示其mRNA表达水平。

1.2.4 统计学处理 实验数据用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。计量资料用 ()表示，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞抑制率 不同处理组分别培养24、48、72 h，黄芩苷对A549敏感细胞生长均有抑制作用，并且具有量效、时效关系。见图1。黄芩苷作用A549细胞IC10值分别为:1.22、0.71、0.65 mg/L，IC50值分别为:7.38、5.04、3.94 mg/L，确定细胞抑制率≤10%的浓度为非细胞毒性浓度，因此选黄芩苷质量浓度为1.22 mg/L作用24 h作为试验的安全剂量。

图1 黄芩苷对A549细胞的抑制作用

2.2 黄芩苷对A549细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表达的影响 RT-PCR结果显示:与对照组细胞相比，黄芩苷处理组Bax、Caspase-3 mRNA表达水平显著升高 (P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表达水平显著下降 (P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值显著降低 (P＜0.01)。见表1，图2。

表1 黄芩苷对A549细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表达的影响(RF-PCR结果)(x ± s，n=6)

图2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达的变化

3 讨论

肺腺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在我国，肺腺癌死亡居恶性肿瘤首位［7］，同时，由于缺乏有效的早期发现手段，中晚期病例5年生存率仅约10%［8］，化疗依然是肺腺癌治疗的主要手段之一，但不良反应及多药耐药的形成严重影响化疗效果和患者生存质量，是临床肺腺癌化疗失败的重要原因，而中医中药恰恰弥补了这些不足。中医认为肺癌是由于邪毒内侵、肺络受损、气血虚弱、痰瘀阻肺导致的。因此，针对病机结合中药治疗以提高化疗效果、减轻毒副反应已成为当前临床研究的热点。

黄芩为唇形科植物，其干燥根味苦，性寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎等功效。黄芩苷是从黄芩中分离出来的黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分，具有多种药理作用［1-5］。也有研究表明，黄芩苷能抑制Mc3肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞分化及促进调亡［6］。本研究通过MTT法试验证实，黄芩苷能够显著抑制A549细胞生长，提示其对肺腺癌细胞具有明显的抑制作用。

为了探讨黄芩苷对肺腺癌细胞抑制作用的机制，我们进一步检测了凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，探讨黄芩苷对肺腺癌细胞影响的机制。Caspase-3被认为是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，所以，本实验对肺腺癌A549细胞Caspase-3的表达进行了检测。结果发现，黄芩苷作用后，细胞Caspase-3表达水平升高，提示黄芩苷具有促进肺腺癌SGC27901细胞凋亡的作用。Bcl-2、Bax是细胞凋亡过程中的一类重要调节因子，Bcl-2位于核膜、粗面内质网及线粒体膜上，其主要生物学功能为延长细胞寿命，增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗性［9］，Bcl-2作为凋亡抑制蛋白，除可通过多种途径抑制凋亡，还可导致肿瘤MDR［10］，本研究显示，A549细胞中Bcl-2基因表达量在黄芩苷作用后明显下降，提示黄芩苷可通过抑制Bcl-2表达逆转肿瘤细胞的凋亡抵抗。与Bcl-2相同，Bax位于线粒体膜、内质网膜和核膜的胞质面上，是Bcl-2的同源体，能与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2作用。Bcl-2/Bax也能形成同源二聚体，抑制线粒体细胞色素C释放，促进细胞凋亡［11］。本研究发现，黄芩苷作用后A549细胞Bax表达明显增强，Bcl-2/Bax比值显著降低，说明该药可使肿瘤细胞易于凋亡。

本研究初步证实黄芩苷可诱导肺腺癌细胞凋亡，具有抑制肺腺癌的生长作用。但本研究仅检测了凋亡相关因子mRNA水平的表达变化，具体的转导机制尚未深入研究；另外，应进行体内实验予以验证体外实验结果，以期更好的为黄芩苷诱导肺腺癌细胞凋亡、改善肺腺癌治疗效果提供理论依据。

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