腺梗豨莶抗风湿化学成分研究

赵凯华，刘 珂，赵 烽

（烟台大学 药学院，山东 烟台 264005）

豨莶草为菊科豨莶属一年生草本植物，主要功效为：祛风湿，利筋骨，治风湿顽痹；消炎止痛。2005年版药典中记载：豨莶丸可清热祛湿，散风止痛［1］。笔者前期以抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞释放NO及TNF-α为活性指标，明确了石油醚层为其抗风湿的主要活性部位［2］。为进一步阐明其抗风湿的作用物质基础，进一步从石油醚层提取分离得到4个单体化合物，通过理化常数测定、化学反应及波谱分析等手段鉴定了结构。活性测试结果表明，化合物1～3对LPS诱导巨噬细胞释放NO具有明显的抑制活性，IC50分别为13.1μg／mL，13.9μg／mL，5.9μg／mL，优于阳性药物氢化可的松。化合物3还对巨噬细胞释放TNF-α具有明显的抑制作用，IC50为1.6μg／mL。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

腺梗豨莶购自药材市场，由沈阳药科大学生药教研室孙启时教授鉴定为腺梗豨莶Siegesbeckia pubescens Makino；小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7为烟台大学药学院自行保种（ATCC TIB-71）；RPMI 1640、胎牛血清购自 Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗溶液、胰酶消化液、小鼠TNF-α ELISA试剂盒为烟台赛尔斯生物技术有限公司产品。

1.2 细胞培养

RAW 264.7细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养，隔天传代。

1.3 对LPS诱导巨噬细胞释放NO的抑制活性测定

按照文献［2］描述的方法进行。

1.4 ELISA法测定TNF-α

按照文献［3］描述的方法进行。

2 结果

2.1 提取分离

腺梗豨莶10kg粉碎，甲醇渗漉2天，重复3次，减压回收甲醇得浸膏595.8g。分散至水中，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，浓缩干燥得石油醚浸膏123.3g，乙酸乙酯浸膏114.9g，正丁醇浸膏100.8g，水层165.3g。石油醚部位用硅胶色谱柱，以正己烷-乙酸乙酯不同梯度混合溶剂反复柱层析，薄层层析监控，相同组分合并，共得到16个子馏分。将活性较好的6个馏分（9～11，13～15）继续反复柱层析，薄层层析监控，并结合制备薄层和柱层析得到化合物1～4。

2.3 结构鉴定

化合物1：白色粘状固体，m.p.70℃～70.5℃，易溶于氯仿，乙醚，难溶于水。13C-NMR谱中δ180.1处碳信号表明该化合物存在羧基，1H-NMR谱中芳香区无任何信号，因此化合物可能为饱和脂肪酸类，结合1H-NMR、13C-NMR谱确定分子式为C24H48O2。其理化性质及波谱数据与文献［4］报道的二十四碳酸（tetracosa-carbonic acid）一致。

化合物2：白色片状结晶，m.p.137℃～139℃。与β-谷甾醇标准品混合物熔点不下降，在硅胶薄层色谱上10%硫酸显紫红色，并且与β-谷甾醇标准品共薄层Rf值一致。其理化性质及波谱数据与文献［4］报道的β-谷甾醇（β-sitosterol）一致。

化合物3：白色针状晶体，m.p.298℃～303℃。DEPT谱中显示该化合物中有7个伯碳，9个仲碳，7个叔碳，7个季碳。结合碳谱可推断其分子式可能为C30H48O3。1HNMR（400MHz，C5D5N）谱中，在δ0.62～1.50的高场间，共出现了5个甲基单峰信号0.89，1.02，1.06，1.23，1.25，说明该化合物有可能是三萜类，所对应的碳信号分别为：15.6，17.5，16.5，23.9，28.8。同时还有2个甲基双峰信号0.96和1.00，分别对应的碳信号为21.4和17.4，提示该三萜化合物为乌苏烷型三萜。氢谱在δ5.49处有一三峰，可能是一双键氢信号，从HSQC中可以知道其所对应的碳信号为125.6，同时低场区139.2处还有一季碳信号，可以推断该化合物中存在-CH2-CH＝C-结构。179.9处碳信号表明该化合物中可能存在羧基基团。氢谱中3.47（1H，t）所对应的碳信号为78.1，说明该碳可能与氧相连，其结构片段可能为-CH2-CH-OH。综上所述，推断该化合物中含有单羟基取代的12-烯-28-酸结构单元。谱图数据见表1，综合其理化性质及波谱数据与文献［6］报道的熊果酸（ursolic acid）一致。

化合物4：羽毛状结晶，m.p.186℃～187℃。1H-NMR（400MHz，CDCl3）谱中，芳香区有15个氢信号，可能存在三个单取代苯环，分别为：7.71（2H，d，J＝8.0Hz），7.52（1H，tt，J＝8.0Hz），7.44（2H，t，J＝8.0Hz），7.29（2H，m），7.24（3H，m），7.15（3H，m），7.07 （2H，m），由 HSQC 谱可知道，所对应的碳信号分别为：127.0，131.9，128.6，128.7，129.3和127.1，128.5和126.7，129.1。低场区136.7，136.6，133.7为三个苯环上的季碳信号。氢谱中6.78（1H，d，J＝7.6Hz），6.02 （1H，d，J＝8.6Hz）两 个 氢信号没有与之相对应的碳信号，说明该化合物中存在两个NH结构。3.92（1H，dd），3.81（1H，dd）对应64.7一个碳信号，说明该仲碳可能与手性碳相连。3.23（1H，dd），3.06（1H，dd）与38.4相对应，同样是一个与手性碳相连的仲碳。2.03处为一个与羰基相连的甲基信号。13C-NMR（100MHz，CDCl3）谱中，170.7，170.2，167.1为三个酯羰基或酰羰基信号。结合HMBC谱，确定该化合物结构，波谱数据见表2，与已知文献［7］报道的N-（N-苯甲酰基-L-苯丙胺酰基）-O-乙酰基-L-苯丙氨醇（N-（N-ben-zoyl-L-phenylalanyl）-O-actyl-L-phenylalanol）基本一致。但如下图所示：从其HMBC谱中可以看到 H-7’（δ：7.13）与C-6’（δ：128.7）远程相关，H-5’（δ：7.07）与C-7’（δ：126.7）远程相关，所以文献中C-7’的化学位移应由128.5改为126.7。同样：H-4”（δ：7.44）与C-3”（δ：127.0），C-2”（δ：133.7）远程相关，文献中C-4”的化学位移应由126.7改为128.6。

表1 化合物3中的1 H-NMR and 13C-NMR谱图数据（C5D5N）

表2 化合物4中1 H-NMR and 13C-NMR谱图数据（CDCl3）

图1

2.3 化合物1～4对巨噬细胞释放NO和TNF-α的抑制

表3 化合物1～4对巨噬细胞释放NO和TNF-α的抑制活性结果

3 讨论

笔者从腺梗豨莶抗风湿的主要活性部位分离鉴定了4个单体化合物，1-3对LPS诱导巨噬细胞释放NO具有明显的抑制活性，IC50分别为13.1μg／mL，13.9μg／mL，5.9μg／mL。化合物3还对巨噬细胞释放TNF-α具有明显的抑制作用，IC50为1.6μg／mL，优于阳性药物氢化可的松，以上结果为阐明腺梗豨莶抗风湿的作用物质基础提供了实验依据。

［1］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［2］赵凯华，赵烽，刘珂.腺梗豨莶提取物对脂多糖活化巨噬细胞释放一氧化氮的抑制作用［J］.烟台大学学报，2009，22（2）：137-140.

［3］ZHAO F，XU H，WANG L，et al.Inhibitory effects of sesquiterpenes from Saussurea lappa on the overproduction of nitric oxide and TNF-αrelease in LPS-activated macrophages［J］.J Asian Nat Prod Res，2008，10（11）：1045-53.

［4］高辉，李平亚，李德坤，等.腺梗豨莶的化学成分研究［J］.中草药，2003，34（7）：597-598.

［5］李清华，张连龙，吴宗好.安徽贝母二萜成分的研究［J］.中国中药杂志，1990，15（2）：170.

［6］王永学，陈正跃，邱培勇，等.大叶香茶菜中的三萜化学成分分析［J］.新乡医学院学报，2008，26（6）：550-552.

［7］邹澄，张荣平，赵碧涛，等.紫菀活性酰胺研究［J］.云南植物研究，1999，21（1）：121-124.