响应面优化超声波辅助提取发芽糙米黄酮工艺

刘振春，张利宽，于 畅，冯建国

(吉林农业大学食品与科学工程学院，吉林 长春 130118)

响应面优化超声波辅助提取发芽糙米黄酮工艺

刘振春，张利宽，于 畅，冯建国

(吉林农业大学食品与科学工程学院，吉林 长春 130118)

以体积分数50%的乙醇溶液为提取溶剂，采用超声技术从发芽糙米中提取黄酮类化合物。采用Box-Behnken响应面设计法建立影响因素的二次回归模型。通过响应面分析得到超声波辅助提取发芽糙米黄酮的最佳提取条件为超声时间11.7min、浸提温度45.8℃、浸提时间30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，发芽糙米黄酮的提取量可达(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，达到理论值0.754mg/g的98.5%。该回归模型模拟度良好，可以作为发芽糙米黄酮提取量测定的理论依据。

发芽糙米；黄酮；超声波；响应面

我国稻谷年产量约2亿吨，占全国粮食总产量的2/5，占世界稻谷产量的1/3，世界上有近一半的人以稻谷为主食[1]。随着对发芽糙米中主要活性成分[2]及生理功能[3]的研究发现糙米的营养价值是精米难以媲美的。因此糙米及其活性成分的研究具有极大的开发潜力。

发芽糙米是指优质糙米在一定的温度条件下浸泡之后控制其发芽，并使其发芽长度保持在0.5～1mm的湿制品或干制品。糙米的发芽过程实质[4]是糙米中所含有的大量酶被激活和释放，并从结合态转化为游离态的生化过程。正是由于这一生理过程，发芽后的糙米糠层纤维被软化[5]，从而改善了糙米的蒸煮性、口感和消化性[6-7]；糙米发芽之后产生了很多功能性成分，如可溶性糖、多肽、GABA、阿魏酸、谷胱甘肽、角鲨烯、肌醇、肌醇六磷酸等[8-10]。与糙米相比，发芽糙米的生理活性[11-12]具有明显的优势。本实验采用Box-Behnken响应面设计法对超声波辅助提取发芽糙米提取黄酮工艺进行优化，以期为发芽糙米中黄酮提取工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市购糙米，经发芽[13]干燥、微粉碎后备用。

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯；芦丁(标品级) 天津一方科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FDV DUTPUT-2HP型原泰奇气引式超微粉碎机 日本佑琦有限公司；JY99-2D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器 金坛市医疗器械厂；FA1004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；LXJ-ⅡB离心机 上海安亭科学仪器厂；UV mini-1240型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司.。

1.3 方法

1.3.1 发芽糙米黄酮的超声波辅助提取工艺流程

1.3.2 标准曲线方程的建立[14]

精确称取0.020g芦丁标品，用体积分数50%乙醇溶液溶解，溶液定容至100mL，配制成0.2mg/mL芦丁标准液。分别吸取0.2mg/mL芦丁标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于6个25mL容量瓶中，依次编号0～5；各加5% NaNO2溶液0.4mL，摇匀，放置6min；然后各加10% Al(NO3)3溶液0.4mL，摇匀，放置6min；然后再各加1mol/L NaOH溶液4mL，最后用50%乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，放置15min，于波长510nm处测定吸光度，回归方程为：

式中：A为吸光度；C为芦丁质量浓度/(mg/mL)。

1.3.3 样品中黄酮类化合物的测定

将发芽糙米用微粉碎机粉碎，过100目筛。准确称取2g样品置于100mL小烧杯中，按照一定的料液比加入提取溶剂，将烧杯放入水浴恒温振荡器中恒温振荡浸提，然后5000r/min离心10min，取2mL上清液于25mL容量瓶中，按照NaNO2-Al(NO3)3法测定吸光度，然后按照下式计算出发芽糙米黄酮提取量(以芦丁计)[15]。

式中：Y为黄酮提取量/(mg/g)；A为吸光度；V为二次离心之后的上清液体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.4 数据分析

使用Design-Export 7.0.0对数据进行响应面分析及模型拟合。

2 结果与分析

2.1 超声时间对发芽糙米黄酮提取的影响

在发芽糙米黄酮提取过程中，超声波处理对物料的破壁作用明显，对黄酮的提取率有影响，因此将超声时间作为单因素来考察。以体积分数50%乙醇溶液为提取溶剂，取液料比为20:1(mL/g)，分别考察超声时间为6、9、12、15、18min的条件下的发芽糙米黄酮提取量，结果见图1。

图1 超声时间对黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on extraction rate of flavonoids

由图1可知，发芽糙米黄酮的提取量随着超声时间的增加而增加，但12min后随着超声时间的延长而降低，可能是超声对黄酮的破坏或者其他的因素引起的，因此选取超声处理12min较为合适。

2.2 浸提温度对发芽糙米黄酮提取的影响

以体积分数50%的乙醇溶液为提取溶剂，取液料比为20:1，超声处理12min后分别在25、35、45、55、65℃条件下提取30min，结果如图2所示。

图2 浸提温度对黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of flavonoids

由图2可知，随着温度的升高，黄酮提取量显著增加，但是45℃后增加趋于平缓略有下降，考虑到高温可能改变物质结构和使体系发生其他反应，取45℃为最佳浸提温度。

2.3 浸提时间对发芽糙米黄酮提取的影响

以液料比20:1加入体积分数50%的乙醇溶液，在45℃条件下分别提取20、30、40、50、60min，结果如图3所示。

由图3可知，随着浸提时间的延长，发芽糙米黄酮提取量在30min内显著增加，此后浸提时间对黄酮的提取量影响很小。从操作费用和能源消耗考虑，因此初步确定30min为最佳浸提时间。

图3 浸提时间对发芽糙米黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

2.4 液料比对发芽糙米黄酮提取的影响

液料比对黄酮的溶出有直接的影响，也会对黄酮的提取造成影响。因此取不同的液料比，以体积分数50%的乙醇溶液为提取剂，超声处理12min后在45℃条件下提取30min，结果如图4所示。

图4 液料比对发芽糙米黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of flavonoids

从图4可知，随着液料比的增加，黄酮的提取量在不断的增高，这是因为增加液料比，传质动力增加，黄酮就更容易溶出，损失减少；但液料比大于20:1后增加速度趋于平缓。因此考虑经济效益，选取液料比为20:1(mL/g)。

2.5 响应面优化设计

2.5.1 试验因素水平编码与试验结果

综合单因素试验结果，根据Box-Behnken试验设计原则，以黄酮提取量为响应值，分析超声处理时间、浸提温度、浸提时间、料液比四因素三水平的响应面分析方法，各因素及水平编码如表1所示。试验设计及结果见表2。

表1 超声波辅助提取发芽糙米黄酮工艺响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

表2 超声波辅助提取发芽糙米黄酮工艺响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2 数据分析及模型建立

表3 二次响应面回归模型方差分析及显著性检验结果Table 3 ANOVA for the developed regression model

应用Design-Expert软件，对表2中的数据进行回归拟合分析，选择对响应值影响显著的各项，可得二次回归方程为：

对回归方程进行方差分析及显著性检验的结果见表3。由表3可知，该回归模型显著(P＜0.0001)方程的一次性和二次项的影响都显著，且交互项AB、AD、BC也显著，且该模型的R2＝0.9679，R2Adj＝0.9359，说明该模型与试验值拟合较好，可用于发芽糙米黄酮提取量评定的理论依据。

2.5.3 响应面因素水平的优化

回归方程中影响显著的交互项所做的响应曲面区及其等高线图见图5。

图5 各两因素交互作用对发芽糙米黄酮提取量影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on extraction rate of flavonoids

通过该组图即可对任何两个因素交互影响发芽糙米黄酮提取量的效应进行分析和评价。通过矩阵分析得响应值Y有最大值时各因素的水平为A＝－0.1、B＝0.08、C＝0.05、D＝－0.22，转换后可得发芽糙米黄酮的最佳提取条件为超声时间11.7min、浸提温度45.8℃、浸提时间30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，此时黄酮提取量为0.754mg/g。

2.6 验证实验

对最佳提取工艺进行验证实验，得发芽糙米黄酮提取量实测值为(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，比理论值0.754mg/g稍低，说明由于试验条件的限制，回归模型中还存在一些干扰因素。

3 结 论

采用Box-Behnken响应面法建立影响因素的二次回归模型，对数据进行分析，得到发芽糙米黄酮的最佳提取工艺为超声时间11.7min、浸提温度45.8℃、浸提时间30.5min、料液比18.9:1(mL/g)，试验误差小，可用来实际预测和评价发芽糙米黄酮提取量的理论依据。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Flavonoids from Germinated Brown Rice Using Response Surface Methodology

LIU Zhen-chun，ZHANG Li-kuan，YU Chang，FENG Jian-guo
(College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Total flavonoids were extracted from geminated brown rice by ultrasound-assisted extraction method using 50%ethanol as extraction solvent. Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions based on extraction rate. A quadratic regression model describing the effects of four process conditions on the extraction rate of total flavonoids was developed using a Box-Behnken experimental design. The response surface analysis showed that the optimal extraction conditions were extraction for 30.5 min at 45.8 ℃ and a material/liquid ratio of 18.9:1 (mL/g) after 11.7 min of ultrasound treatment. Under these conditions, the average extraction rate of total flavonoids was (0.743 ± 0.011) mg/g (n = 5),accounting for 98.5% of the predicted value, 0.754 mg/g. The developed regression model showed excellent goodness of fit.

germinated brown rice；flavonoids；ultrasound；response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630(2012)08-0080-05

2011-03-25

吉林省科技厅重点项目(2010026)

刘振春(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与功能性食品。E-mail：liuzhenchun63@163.com