一种薏苡抗真菌蛋白的制备及抑菌活性研究

李 晨，白承之，李玉英，王转花*

(化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006)

一种薏苡抗真菌蛋白的制备及抑菌活性研究

李 晨，白承之，李玉英，王转花*

(化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006)

以薏苡(Coix chinensis)种子为实验材料，通过脱脂、水提、Resource S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶排阻层析等步骤纯化得到一种新的抗真菌蛋白，并对其抑菌活性进行初步鉴定。SDS-PAGE分析显示该蛋白的分子质量约为28kD。抑菌活性鉴定表明，该蛋白对链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus) 3株丝状真菌具有显著的生长抑制活性，并呈现出剂量依赖的特征。本研究建立分离薏苡28kD抗真菌蛋白的方法，制备方法简单易行，所得产品纯度达到95%以上。

薏苡种子；抗真菌蛋白；纯化

植物种子中普遍含有一种或几种抗真菌蛋白(antifungal proteins，AFPs)，这类蛋白赋予植物种子或植株抵抗真菌侵蚀的能力。天然植物AFPs具有来源广泛，抗菌谱广，无污染等特点，成为研究的热点之一。随着研究的深入，发现有些AFPs还可以抑制HIV-1反转录酶[1-3]。近年来，陆续有多种植物来源的AFPs被纯化和鉴定[4]，这些蛋白的分子质量大小不同，从几千到60kD不等。2005年，巴西科学家在高粱种子中纯化并鉴定了一种分子量为30kD的抗真菌蛋白[5]。国内学者先后从花生[6]、黑豆[7]、红扁豆[8]中纯化得到抗真菌蛋白并对它们的抑菌活性进行了鉴定。

薏苡为禾本科一年生或多年生草本植物，去除外壳和种皮的种仁可入药，《本草纲目》中提及薏苡种子“健脾益胃、补肺清热、祛风胜温、强筋骨”。薏苡种子富含脂肪、多种氨基酸、大量的VB1、VB2以及钙、磷、镁、钾等生物活性成分，是非常有价值的药食同源食品[9]。薏苡在我国大部分地区均有种植，国家对薏苡种子的开发利用也很重视。最近，研究者从薏苡麸皮中提取出几种可以抑制乳腺癌细胞的小分子活性物质[10]。2008年，刘静等[11]以薏苡蛋白为实验材料筛选其中的抗菌成分，获得一种分子质量约38kD的抗真菌蛋白。一种植物中可能含有多种AFPs[12]，有关薏苡中新的抗菌蛋白及其详细的抑菌活性有待深入研究。本实验以薏苡种子为材料提取其总蛋白，通过两步层析分离，纯化得到一种抗真菌蛋白，并对该蛋白的分子质量和抑菌活性进行研究，为深入开展制备植物种子来源的抗真菌蛋白提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与仪器

链格孢霉(Alternaria a lternata)、白腐菌(Panus conchatus)、绿色木霉(Trichoderma reesei)由山西大学生命科学学院提供；实验所用试剂均为分析纯。

薏苡种子购自当地市场。

Resource S离子交换层析柱、Superdex 75 10/300 GL层析柱 美国GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 薏苡种子抗真菌蛋白的纯化

薏苡种子经过低温干燥后粉碎，过0.2mm孔径筛网，以3:1(V/m)的比例加入丙酮，4℃搅拌脱脂3h后减压抽滤，向所得滤饼中加入乙醚，低温搅拌3h，减压抽滤，滤饼低温干燥后即为薏苡种子脱脂粉。取薏苡种子脱脂粉20g，加入200m L浸提缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，4℃搅拌浸提6h，12000×g离心，取上清，加入硫酸铵至80%饱和度，搅拌提取6h，12000×g离心，沉淀用少量浸提缓冲液溶解后透析，所得蛋白溶液为薏苡种子水溶性总蛋白。

将上述水溶性总蛋白用平衡缓冲液充分透析平衡后，上样于Resource S阳离子交换柱进行分离。平衡缓冲液为20mm ol/L NH4OAc，pH 4.5，洗脱缓冲液为20mmol NH4OAc，1mol/L、pH 4.5的NaCl溶液，控制流速为0.5m L/m in，用0.1、0.2、1mol/L的NaC l洗脱缓冲液进行不连续梯度洗脱，收集各洗脱峰，并进行抗真菌活性的分析。

将具有抑菌活性的洗脱组分上样于Superdex 75 10/300 GL凝胶层析柱进一步分离，缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，内含150mmol/L NaCl，pH 8.0，控制流速为0.5m L/m in。收集各洗脱峰，进行抗真菌活性的筛选。

1.2.2 SDS-PAGE测定分子质量

采用SDS-PAGE法[13]测定，以标准分子质量蛋白为对照，4%浓缩胶，12.5%分离胶。

1.2.3 真菌生长抑制活性测定

采用牛津杯法[14]测定各层析组分的真菌生长抑制活性，受检真菌为链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)。将供试菌株点植于PDA培养基中心，于28℃培养至菌落直径达到1～2cm，在距离菌落边缘1cm处放置灭菌的牛津杯，各取200μL样品组(含目的蛋白)和对照组(不含目的蛋白，其他条件完全相同的缓冲液)，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后加入牛津杯内，4℃预扩散24h，28℃继续培养72h，观察菌落生长状况。

2 结果与分析

2.1 薏苡种子抗真菌蛋白的纯化结果

薏苡种子水溶性总蛋白经Resource S阳离子交换柱分离，得到6个蛋白洗脱峰(图1)。经检测，峰Ⅲ具有抗真菌活性，将峰Ⅲ上样于Superdex 75 10/300 GL层析柱进一步分离，得到两个洗脱峰(图2)，经测定，峰Ⅰ具有抗真菌活性。

图1 薏苡种子抗真菌蛋白的Resource S阳离子交换层析Fig.1 Cation exchange Resource S cation exchange column chrom atography for the protein from ad lay seeds

图2 阳离子交换层析活性洗脱峰Ⅲ的Superdex 75凝胶排阻层析Fig.2 Size exclusion chromatographic of fraction III obtained in Resource S cation exchange column fraction on Superdex Pep tide HR 10/300 column

2.2 抗真菌蛋白分子质量测定

图3 薏苡种子抗真菌蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of purified antifungal p rotein from ad lay seeds

采用SDS-PAGE法测定薏苡种子抗真菌蛋白的分子质量，以标准蛋白的相对迁移率和分子质量的对数做标准曲线，根据目的蛋白的相对迁移率，得出其分子质量约为28kD。电泳结果(图3)显示，与薏苡种子水溶性总蛋白(泳道1)相比，目的蛋白(泳道2)得到了高度纯化，其表观纯度大于95%。

2.3 真菌生长抑制活性检测

图4 薏苡种子抗真菌蛋白对3株真菌生长抑制的剂量依赖性实验Fig.4 Effect of P antifungal protein aging

由图4可知，目的蛋白可明显抑制供试霉菌的生长。由于抗真菌蛋白的抑制作用，两株主要依靠菌丝延伸增殖的霉菌，链格孢霉和白腐菌(图4A、C)，在菌落边缘形成类似弦月的抑制形态(图4A-1和图4C-2)。绿色木霉(图4B)依靠孢子增殖，菌丝可以绕过抗真菌蛋白的抑制区继续扩散，抑制区的菌落形成了一个类似抑菌圈的抑制形态(图4B)，随着用样量的增大，呈现出明显的剂量依赖效应，而在相同条件下，对照组(图4B-0)菌丝扩散没有受到影响，菌落边缘呈现规则的圆形。

3 结 论

本实验通过Resource S阳离子交换层析和Superdex 75凝胶排阻层析，从薏苡种子中纯化出一种可以抑制链格孢霉(Alternaria a lternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)生长的抗真菌蛋白。

目前，由于抗生素的大量使用，耐药菌株和多重耐药菌株不断增加，使抗感染治疗成为难题。随着社会的进步，多种添加剂因为不符合新的安全要求而被停止使用。植物种子来源的抗真菌蛋白因来源广泛，抗菌谱广，不易产生抗药性，无毒副作用[15]等特点，在新型药物开发、食品添加剂、化妆品和保健食品等方面有广阔的开发前景[16]。本实验以薏苡种子为研究对象，获得了一种新的薏苡28kD抗真菌蛋白，对3株常见的农业致病真菌有显著的生长抑制作用。该蛋白的结构特征以及是否具有抗肿瘤作用正在进一步研究中。本研究建立的薏苡抗真菌蛋白提取技术简单，目的蛋白纯度较高，为进一步研究其抗病机理及植物原添加剂应用于农作物保护和食品工业领域奠定基础。

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Isolation and Antifungal Properties of a New Protein from Adlay Seeds (Coix chinensis)

LI Chen，BAI Cheng-zhi，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

A protein from adlay (Coix chinensis) seeds was isolated by degrease with acetone and ether, extraction with 20 mmol/L Tris-HCl buffer, ion exchange chromatography on Resource S column and size exclusion chromatography on Superdex 75 column. The purity was higher than 95%. Partial characterization and antifungal activity were assayed. The protein exhibited a molecule mass of 28 kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. This protein could exert potent inhibitory activity toward fungal species includingAlternaria alternate,Trichoderma reeseiandPanus conchatusin a dose-dependent pattern. Antifungal protein has become a popular research topic because of their resistance to pathogenic diseases. In this paper, the studies have demonstrated that adlay seeds have potentially exploitable significance and explored an effective method for the isolation and purification of antifungal proteins from plant seeds.

adlay seeds；antifungal protein；purification

Q516

A

1002-6630(2012)05-0046-03

2011-08-17

国家自然科学基金面上项目(30970611；31171659)；山西省科技攻关计划项目(20100321101)

李晨(1981—)，女，博士研究生，研究方向为生物活性物质。E-mail：lichen@sxu.edu.cn

*通信作者：王转花(1956—)，女，教授，博士，研究方向为植物基因工程与蛋白质工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn