石榴贮藏期间褐腐病病原菌的分离、鉴定及不同理化因素对其生长繁殖的影响

张润光，张有林，赵蕾丹，尹海丽，夏 妮，田玉婷

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

石榴贮藏期间褐腐病病原菌的分离、鉴定及不同理化因素对其生长繁殖的影响

张润光，张有林*，赵蕾丹，尹海丽，夏 妮，田玉婷

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

对引起陕西临潼和新疆喀什石榴贮藏期间褐腐病的病原菌进行了分离与鉴定，研究了温度、pH、壳聚糖、杀菌剂等理化因素对石榴病原菌生长繁殖的影响。结果表明，临潼石榴褐腐病病原菌为黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴褐腐病病原菌为紫变青霉（P.purpurogenum Stoll）。0℃的低温能抑制但不能终止两种病原菌的生长；临潼石榴黑曲霉在pH3～11范围内均有孢子繁殖，pH5时繁殖最快；喀什石榴紫变青霉在pH7时孢子繁殖最快，低于或等于3时停止生长。多菌灵、铜大师、代森锰锌对两种霉菌生长的抑制效果不明显，甲基托布津可完全抑制两种霉菌的孢子繁殖。壳聚糖安全无毒，对两种霉菌均有较好的抑制作用，是一种良好的石榴涂膜保鲜剂。

石榴，褐腐病，病原菌，分离鉴定，理化因素

石榴（Punica granatum L.），属石榴科石榴属落叶灌木，在我国亚热带及温带地区的20多个省市自治区均有分布。石榴果形奇特，籽粒艳丽，营养丰富，味美可口，具有生津化食、祛热消暑等功效，深受消费者喜爱[1]。石榴采后贮藏期间易滋生病菌，导致果实褐变腐烂[2-3]。有研究发现引起石榴干腐病的病原菌是石榴鲜壳孢[4]；也有人认为石榴发生软化腐烂，其病原菌可能为真菌类的曲霉菌[5]。目前，国内外有关石榴的研究报道较多，但主要集中在石榴的营养保健功能方面，对其采后生理病害研究相对较少[6-8]。本文在对临潼石榴和喀什石榴贮藏期间褐腐病病原菌进行分离鉴定的基础上，研究了温度、pH、壳聚糖、杀菌剂等因素对病原菌生长繁殖的影响，为防治石榴贮期病害、延长果实贮藏期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴 选用陕西临潼净皮甜石榴和新疆喀什甜石榴，采收后在5℃下冷库中贮存，待有病菌大量生长，果实开始褐变腐烂时对病原菌进行分离。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、孟加拉红培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基 实验室自制；50%多菌灵超微可湿性粉剂 中国潍坊华威生化有限公司；铜大师（86.2%氧化亚铜可湿性粉剂） 挪威劳道克斯公司；70%代森锰锌可湿性粉剂 江苏福田农药有限公司；70%甲基托布津可湿性粉剂 滨州澳尔农化有限公司；壳聚糖 上海源聚生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

MJX-280H型智能霉菌培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂；S.SW-CJ-IF型净化工作台 上海跃进医疗器械厂；GSP-9080MBE型隔水式恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BCD-206T型冰箱

青岛海尔股份有限公司；PHS-3C型精密酸度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石榴褐腐病病原菌的培养 于石榴病斑边缘（病健交界处）切取3～4mm病斑组织数块放入100m L无菌水中，振荡均匀，分别吸取1m L菌液移至已灭菌的PDA培养基、孟加拉红培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号培养基平板上，无菌刮铲涂抹均匀，于28℃下培养3d，观察实验结果。

1.2.2 石榴褐腐病病原菌的分离、纯化和鉴定 在无菌条件下，用灭菌接种针挑取目标菌株于100m L无菌水中制成稀释菌液，无菌吸管吸取1m L菌液接种于PDA培养基上，无菌刮铲刮平，置于28℃下培养，如此反复，直至培养出纯化的目标菌株。将目标菌株在28℃下分别培养5、8、12d，肉眼观察病原菌在PDA平板上生长的菌落特征，显微镜下观察病原菌的个体形态特征，并查阅相关文献对其做初步鉴定，然后将菌种样本送至生物科技公司进行测序（即rDNAITS序列分析），依据结果做最终鉴定。

1.2.3 不同理化因素对病原菌生长繁殖的影响 实验所用培养基为PDA培养基。供试菌种经5d平板培养，用直径6mm的打孔器打取菌落边缘的菌块，移入供测定的培养皿内，根据不同要求进行处理，每个处理均设置3个重复，处理后5d，用含0.05%吐温-20的无菌水50m L刮下菌落及孢子，振荡摇匀，制成均匀的孢子悬浮液。从中取3滴于血球计数板上，在显微镜下镜检，每滴计5个视野的孢子数，求得15个视野的平均数，最终统计出每皿孢子数量，进行方差分析，计算各处理间孢子数的差异显著性[9]。

1.2.3.1 温度实验 将移植有菌块的PDA平板置于28、15、5、0℃环境下培养5d。

1.2.3.2 pH实验 用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调配PDA培养基，使其pH分别为3、5、7、9、11，移入菌块在28℃下培养5d。

1.2.3.3 壳聚糖实验 将pH为5.5的壳聚糖溶液经灭菌后，加入无菌融化的PDA中，分别获得壳聚糖浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0mg/m L的PDA培养基，移入菌块在28℃下培养5d。

1.2.3.4 杀菌剂实验 将多菌灵、铜大师、代森锰锌、甲基托布津等高效广谱杀菌剂分别稀释600、800、 1000、1200和1500倍，各取1m L稀释液加入无菌融化的PDA中，凝固后移入菌块，在28℃下培养5d。

1.4.4 数据处理与分析 实验数据采用DPS统计软件进行方差分析，多重比较采用Duncans新复极差测验，显著水平α=0.05[10]。

2 结果与分析

2.1 石榴褐腐病病原菌的生长状况

不同培养基上病原菌的生长情况不一。一般来说，PDA培养基和孟加拉红培养基适合霉菌生长，牛肉膏蛋白胨培养基适合细菌生长，高氏一号培养基适合放线菌生长。由图1、图2看出两种石榴病原菌在PDA培养基和孟加拉红培养基上生长良好，而在牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号培养基上均不生长，由此说明石榴贮期褐腐病病原菌为霉菌。

图1 临潼石榴褐腐病病原菌在不同培养基上的生长状况Fig.1 Grownth situation of the pathogen of browning rotten disease from Lingtong pomegranate on differentmedium

图2 喀什石榴褐腐病病原菌在不同培养基上的生长状况Fig.2 Grownth situation of the pathogen of browning rotten disease from Kashipomegranate on differentmedium

2.2 石榴褐腐病病原菌的鉴定

通过石榴贮藏期间主要病害症状观察、病原菌个体形态观察（图3、图4）和培养菌落形态观察（图1、图2），经查阅相关文献并结合分子生物学测序，最终鉴定得出临潼石榴褐腐病病原菌为曲霉属黑曲霉组的黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴褐腐病病原菌为青霉属紫变青霉组的紫变青霉（P.purpurogenum Stoll）[11]。本实验发现，黑曲霉感染临潼石榴后，果实初期呈水渍状褐班，果面软化腐烂，后在烂果表面产生大量黑霉点状物。紫变青霉感染喀什石榴后，受害果实表面产生青绿色霉层，造成果实干腐褐变，并发出特殊香味。

图3 临潼石榴褐腐病果实外观表现、内部性状及病原菌个体形态（×40）Fig.3 Surface symptom,internal character and individual pathogenmorphology of browning rotten disease from Lingtong pomegranate（×40）

图4 喀什石榴褐腐病果实外观表现、内部性状及病原菌个体形态（×40）Fig.4 Surface symptom，internal character and individual pathogenmorphology of browning rotten disease from Kashipomegranate（×40）

2.3 不同理化因素对石榴褐腐病病原菌生长繁殖的影响

2.3.1 温度对病原菌生长繁殖的影响 温度是影响微生物生长最重要的因素之一。从表1可以看出，低温能抑制病原菌生长繁殖。培养5d时经测定，霉菌孢子数随温度的降低而减少，28℃下孢子繁殖最快，0℃下孢子繁殖最慢，各处理间霉菌孢子数差异显著。实验中还发现，两种病原菌在低温条件下虽然生长受到抑制，但仍可缓慢生长。在0℃下培养90d时经测定，培养皿中黑曲霉和紫变青霉的孢子数分别为2.35×108和3.62×108个，表明低温对这两种病原菌没有致死作用，因此它们成为低温贮藏后期引起石榴褐变腐烂的主要病原菌。

表1 不同温度对病原菌生长繁殖的影响Table 1 Effectof different temperature on the reproduction of pathogen

2.3.2 pH对病原菌生长繁殖的影响 微生物在一定的酸碱环境下才能正常地生长繁殖，每种微生物有各自适宜的pH范围和最适pH。从表2可以看出，临潼石榴黑曲霉在pH 3～11范围内均有孢子繁殖，且在pH为5时繁殖速度最快。喀什石榴紫变青霉随pH变化影响较大，pH为7时孢子繁殖最快，pH低于或等于3时停止生长。因此，引起石榴腐烂的黑曲霉、紫变青霉在中性、弱酸、弱碱条件下均能很好地生长，而强酸、强碱条件则可抑制两种病原菌的繁殖。

表2 不同pH对病原菌生长繁殖的影响Table 2 Effectof different pH on the reproduction of pathogen

2.3.3 壳聚糖对病原菌生长繁殖的影响 壳聚糖是一种安全无毒的高分子量阳离子多糖，能在果蔬表面形成一层半透性薄膜调节果蔬采后生理代谢并对微生物有抑制作用，在果蔬保鲜领域应用广泛[12]。从表3可以看出，壳聚糖对临潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫变青霉均有较强的抑制作用。壳聚糖浓度为0.5mg/m L时，临潼石榴黑曲霉有孢子繁殖，喀什石榴紫变青霉无孢子繁殖。当浓度增大到1.0mg/m L时，两种病原菌均停止生长，因此壳聚糖具有抑制石榴褐腐病病原菌生长繁殖的作用。

表3 不同浓度壳聚糖对病原菌生长繁殖的影响Table 3 Effectof different concentration chitosan on the reproduction of pathogen

2.3.4 杀菌剂对病原菌生长繁殖的影响 多菌灵、铜大师、代森锰锌和甲基托布津四种杀菌剂均为高效广谱杀菌剂，分散性和可湿性良好，对多种病害特别是霉菌有显著的防治效果。本研究选用上述四种杀菌剂进行实验，结果见表4。从表4可以看出，多菌灵对临潼石榴黑曲霉的抑制作用较弱，对喀什石榴紫变青霉的抑制作用相对较强。铜大师和代森锰锌对两种霉菌的抑制效果不佳。甲基托布津可完全抑制两种霉菌的孢子繁殖，抑菌效果最好。

3 结论

3.1 本实验鉴定出石榴贮藏期间褐腐病病原菌主要是霉菌，临潼石榴病原菌为曲霉属黑曲霉组的黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴病原菌为青霉属紫变青霉组的紫变青霉（P.purpurogenum Stoll）。

3.2 低温对临潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫变青霉有很好的抑制作用，但不能终止其生长繁殖。

表4 不同杀菌剂对病原菌生长繁殖的影响Table 4 Effectof differentgermicide on the reproduction of pathogen

3.3 临潼石榴黑曲霉在pH3～11范围内均有孢子繁殖，且在pH为5时繁殖速度最快。喀什石榴紫变青霉受pH影响较大，pH为7时孢子繁殖最快，低于或等于3时霉菌停止生长。

3.4 壳聚糖对临潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫变青霉均有较好的抑制作用，壳聚糖浓度≥1.0mg/m L时，两种霉菌停止生长。多菌灵对临潼石榴黑曲霉的抑制作用较弱，对喀什石榴紫变青霉的抑制作用较强。铜大师和代森锰锌对两种霉菌的抑制效果较差。甲基托布津可抑制两种霉菌生长，但具有低毒性。综合考虑，以壳聚糖涂膜保鲜石榴为好。

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Separation and identification the pathogens of browning rotten disease of pomegranate during storage and effect of different physicaland chem ical factors on its reproduction

ZHANG Run-guang，ZHANG You-lin*，ZHAO Lei-dan YIN Hai-li，XIA Ni，TIAN Yu-ting
（College of Food Engineering and Nutritional Science，ShaanxiNormal University，Xi’an 710062，China）

Pathogens causing the browning rotten disease of Shaanxi Lingtong and Xinjiang Kashipomeg ranate fruits during storage were separated and identified.Effect of physical and chemical factors such as temperature，pH，chitosan and germicide on the rep roduction of pomeg ranate pathogen were stud ied in the paper.The result showed that the browning rotten pathogen of Ling tong pomegranate was A.niger V.Tiegh. and the b rowning rotten pathogen of Kashi pomegranate was P.purpurogenum Stoll.These pathogens could be restrained but not be term inated at 0℃.Spores of A.niger V.Tiegh.could b reed between pH3 and pH11，they rep roduced fastest at pH5.Spores of P.purpurogenum Stoll increased fastest at pH7，while they stopped growing at pH≤3.Supp ressive effec t of carbendazim，cup rous oxide and mancozeb on A.niger V.Tiegh.and P.purpurogenum Stoll were not obvious.However，Triophanate-methyl could inhibit the rep roduc tion ofmold spores com p letely.Chitosan was innocuous and had a better inhibitory effect on the mold.It was a good kind of coating antistaling agent for pomeg ranate.

pomeg ranate；b rowning rotten d isease；pathogen；purification and identification；physicaland chem ical factor

TS255.3

B

1002-0306（2012）22-0338-04

2012－08－22 *通讯联系人

张润光（1980-），男，博士研究生，研究方向：食品保藏。

陕西省科技厅农业科技创新项目（2011NXC01-07）；中央高校基本科研业务费项目（GK201004008）；陕西师范大学大学生创新创业训练计划项目（CX12118）；陕西师范大学“发展成才计划”实践创新项目。