田口设计优化耶氏酵母生产γ-癸内酯

赵玉萍，徐 岩，朱 春

（1.江南大学生物工程学院酿造科学与酶技术中心，教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 214122；2.淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安 223003）

田口设计优化耶氏酵母生产γ-癸内酯

赵玉萍1，2，徐 岩1，*，朱 春2

（1.江南大学生物工程学院酿造科学与酶技术中心，教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 214122；2.淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安 223003）

通过田口设计对产γ-癸内酯的培养基成分进行优化。根据单因素实验结果，利用Minitab软件设计正交实验，采用田口设计方法分析正交实验中各因素水平的均值情况和信噪比情况。实验结果表明，复合氮源即酵母膏和（NH4）2HPO4对γ-癸内酯产量影响极显著，MgSO4·7H2O对γ-癸内酯产量影响显著。软件预测培养基的最优组合为麸皮20g/L、酵母膏7.5g/L、（NH4）2HPO416.5g/L、KH2PO46g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，预测产量为2.49g/L，信噪比为9.04dB，经验证γ-癸内酯产量为2.65g/L，信噪比为9.68dB，优化方案达到了预期效果，具有较好的稳定性。

γ-癸内酯，耶氏酵母，田口设计，优化

γ-癸内酯（γ-decalactone，GDL）是一种含有五元内酯环的十碳化合物，天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，也存在于乳制品的风味物质中，具有强烈的果香香气，稀释时有桃子香气[1-4]。1969年，GDL被美国有关食品组织认为是安全的食品添加剂和药物添加剂[4]。γ-癸内酯是手性分子，从水果中提取的γ-癸内酯具有特定的立体结构，而化学法生产的却是消旋体，因此，用生物法生产光活性γ-癸内酯的工作吸引了许多研究人员的关注[5-8]。Rabenhorst等[9]利用解脂酵母HR 145发酵生产γ-癸内酯，产量达11.5～ 12.5g/L。徐勤等[10]采用紫外诱变毕赤酵母发酵生产γ-癸内酯，产量达1.25g/L。田口设计又可称为田口方法（Taguchi Method），20世纪50年代初，日本电讯研究所中，以田口玄一为首的一批研究人员在费歇尔多元配制法实验设计基础上开发了正交实验技术，并利用一套规范化正交表安排实验。该方法将质量管理与经济效益联系在一起，将工程经验与统计原理相结合，运用数学方法，从工程观点、技术观点和经济观点对质量管理的理论和方法进行综合研究，从而形成了一套独具特色的、有效性、通用性、边缘性极强的质量稳健性设计方法[11]。Yun Teng[12]等运用田口方法对全细胞脂肪酶生产研究的培养条件进行优化，通过实验证明，该方法高效、稳健。本文拟采用田口设计的方法优化生产γ-癸内酯的营养性条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 实验室筛选，经诱变和定向选育技术获得的耶氏酵母（Yarrowia sp.CGMCC 2.1405）；种子培养基 参考文献[13]；发酵培养基 葡萄糖15g/L，酵母膏3g/L，（NH4）2HPO413g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，蓖麻油5%，吐温-80 0.2%，pH7.5，用250m L三角瓶，每瓶分装30m L，106℃灭菌20m in备用。

BCM－1000超净工作台 上海和呈仪器制造有限公司；QYC－211恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司；6820气相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养及发酵条件 种子和发酵培养基装液量均为30m L/250m L三角瓶，种子培养和发酵条件均为：温度30℃，摇床转速150r/m in。将斜面种子接入种子培养基培养24h，作为一级种子。将一级种子按5%的接种量接入种子培养基，按上述条件培养，作为二级种子。将二级种子按5%的接种量接入发酵培养基中培养24h后，向培养基中加入5%已灭菌的蓖麻油。将三角瓶放入摇床继续培养至48h后，检测GDL的产量。

1.2.2 碳源、氮源、无机盐、磷酸盐及表面活性剂的选择 采用单因素实验方法，只改变其中一种营养条件，添加量均同发酵培养基的添加量。碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麸皮、玉米粉和薯干粉。以牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作为有机氮源，确定最佳有机氮源后，研究有机氮源与无机氮源（NH4）2HPO4的比例关系，实验条件分别为1∶5、3∶3、5∶1、7∶9、9∶7、11∶5、13∶3和15∶1，总氮源添加量为16g/L。无机盐分别选择NaCl、MgSO4·7H2O和CuSO4·5H2O。以KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4作为磷酸盐研究对象。

1.2.3 田口设计优化培养基 将发酵培养基的碳源、氮源、无机盐及磷酸盐这几个因素水平综合在一起，利用M initab 15软件进行田口实验方案设计，根据设计出的实验方案实施实验，利用此软件对实验结果进行分析，得出优化后的培养基配方。利用Minitab 15软件可以预测出在优化后的培养基配方下能够得到的产物产量及信噪比。按照优化后的培养基配方进行验证实验，将实验得到的实际值与预测值进行比较，评价优化方案。

1.2.4 样品处理及γ－癸内酯定量测定方法 发酵液离心去除菌体，上清液酸化至pH2，乙酸乙酯室温萃取，吸取一定量上层有机相加内标物壬内酯后通过气相色谱进行检测（工作条件：后进样，280℃，采用毛细管柱，检测器FID，300℃。程序升温，初始温度100℃，以10℃/m in升至250℃，保持10m in[13－14]）。γ－癸内酯气相色谱图见图1；GDL产量计算见式（1）：

图1 γ－癸内酯气相色谱图Fig.1 Gas Chromatogram ofγ－decalactone

2 结果与讨论

2.1 碳源的选择

选择葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麸皮、玉米粉和薯干粉作为碳源进行单因素实验以GDL的产量作为考核指标，实验结果如图2所示。

图2 不同碳源对GDL产量的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on GDL yield

通过图2可以看出可溶性淀粉、麸皮、薯干粉对提高GDL的产量有较大的作用，其中以麸皮最为明显，这可能是麸皮中含有较丰富的维生素类物质，对于耶氏酵母的代谢及β－氧化等过程可能具有微量元素等作用，因此有利于耶氏酵母代谢产物GDL的合成。

2.2 氮源的选择

首先是对有机氮源的种类进行实验，选择牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作为实验对象，实验结果如图3所示。

图3 不同的有机氮源对GDL产量的影响Fig.3 Effectof differentnitrogen sources on GDL yield

通过图3可以看出，选用酵母膏作为有机氮源时，发酵产物GDL的产量明显高于其他两种氮源的值，因此确定酵母膏为最适有机氮源。

实验进一步研究酵母膏与（NH4）2HPO4不同比例对发酵产物产量的影响，通过图4可以得出结论，当酵母膏与（NH4）2HPO4的比例为5∶11时最有利于提高GDL的产量。

图4 氮源的不同比例对GDL产量的影响Fig.4 Effectof different ratio of nitrogen sources on GDL yield

2.3 无机盐的选择

选用NaCl、MgSO4·7H2O和CuSO4·5H2O及其不同的水平进行实验，实验结果如表1所示。

表1 不同无机盐及其水平对GDL产量的影响Table 1 Effectof different salts and levels on GDL yield

由表1可以看出，与对照组相比，铜离子的引入会对GDL的产生有抑制作用，降低产物产量。钠离子与镁离子对GDL的产生有促进作用，提高产物产量。钠离子与镁离子的作用相比较，当镁离子的浓度为0.5g·L-1时，其对GDL的合成促进作用最明显。

2.4 磷酸盐的选择

对于KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4这些不同磷酸盐的实验结果如图5所示。

图5 不同磷酸盐对GDL产量的影响Fig.5 Effectof different phosphates on GDL yield

与对照组相比加入磷酸盐可以促进产物GDL的合成，其中KH2PO4和NaH2PO4的作用最为明显，其促进程度也几乎相同。

2.5 田口设计优化培养基

2.5.1 单因素实验确定浓度 选定麸皮、复合氮源酵母膏＋（NH4）2HPO4、MgSO4·7H2O和KH2PO4作为进一步优化的因素，为确定各因素范围，采用单因素实验方法，每次仅改变一个变量的浓度，其他条件均不改变，其他变量浓度按照均按照发酵培养基中的浓度，实验结果如图6～图8所示。

图6 麸皮浓度对GDL产量的影响Fig.6 Effectof differentwheatbran concentrations on GDL yield

图7 复合氮源浓度对GDL产量的影响Fig.7 Effectof different composite nitrogen concentrations on GDL yield

图8 磷酸二氢钾浓度对GDL产量的影响Fig.8 Effect of different KH2PO4 concentrations on GDL yield

由图6～图8可以看出，麸皮、复合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）和KH2PO4对GDL产量有一定的影响，为进一步优化培养基中各组分的浓度，采用田口设计法作深入研究。2.5.2 田口设计实验结果 综合以上单因素实验的结果，选定麸皮、复合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）、MgSO4·7H2O和KH2PO4作为进一步优化的因素，确定三个水平，由图6～图8选定麸皮、复合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）和KH2PO4的水平范围，由表1选定MgSO4·7H2O的水平范围，所选择的因素及因素水平如表2所示。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table

按照M initab 15设计的实验方案实施实验。发酵时的培养条件为摇床转速150r/min，温度为26℃。装液量为30m L/250m L三角瓶，接种量为5%，蓖麻油接入量5%。选择两个摇床作为两个噪声因素进行研究，GDL产量分别用GDL-1和GDL-2表示。利用M initab 15软件，依次选择统计、DOE、田口，创建田口设计选项，在田口设计的对话框中选择4因素3水平，利用软件设计出一张有9组实验的正交表，按此正交表配制成不同的培养基，进行实验并将结果记录于表3。

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal test results

运用Minitab 15软件可以分析实验结果的各因素水平的均值情况和信噪比情况，并且可以得到均值主效应图和信噪比主效应图，通过分析这些图表可确定位置因子、散度因子和调整因子[20]，最终得到培养基最优的因素水平组合。其均值主效应图、信噪比主效应图和均值响应表、信噪比响应表分别如图9、图10和表4、表5所示。

为了找出影响均值和信噪比的显著性因素，对实验结果进行了均值和信噪比的方差分析，分析结果见表6、表7。

图9 均值主效应图Fig.9 Themain effectmap ofmean value

图10 信噪比主效应图Fig.10 Themain effectmap of ratio of signal to noise

表4 所选因素水平的均值响应表Table 4 Mean value response table of selected factor levels

表5 所选因素水平的信噪比响应表Table 5 Ratio of signal to noise response table of selected factor levels

表6 均值方差分析Table 6 Analysis of variance ofmean value

表7 信噪比方差分析Table 7 Analysis of variance of ratio of signal to noise

对均值响应表和均值的方差分析表进行分析可知，对于均值而言因素B为极显著因素，因素C为显著因素。确定因素B、C和D为位置因子。

对信噪比响应表和信噪比的方差分析表分析可知，因素B为显著因素。确定因素A、B和C为散度因子。

对于优化培养基的选择，根据均值和信噪比的主效应图，首先选择位置因子的水平使均值最大，即B3C2D2，再选择非位置因子的散度因子A的第三水平，使散度最小化。最终得出最优培养基的组合为A3B3C2D2，即麸皮20g/L、酵母膏7.5g/L、（NH4）2HPO416.5g/L、KH2PO46g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，由此可以看出当因素A、B是高水平时有利于GDL的产生。

信噪比是田口设计中作为衡量稳健性的重要指标，信噪比的数值越大则稳健性越好。利用Minitab 15预测出在此水平组合下的产量为2.49g/L，信噪比为9.04dB。

2.6 验证实验

按照优化后的培养基组合配制培养基，进行验证实验，得到的验证值为2.65g/L，信噪比为9.68dB，验证值比较接近预测值，说明此优化方案达到了预期的优化效果，且具有较好的稳定性。

3 结论

综上所述，采用Yarrowia sp.CGMCC 2.1405发酵生产GDL，在单因素实验的基础上确定了最佳碳源、氮源、磷酸盐和无机盐，利用M initab软件设计正交实验，采用田口设计方法分析正交实验中各因素水平的均值情况和信噪比情况，经实验分析，得出最优培养基组合为：麸皮20g/L，酵母膏7.5g/L，（NH4）2HPO416.5g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用M initab 15预测出在此水平组合下的GDL产量为2.49g/L，信噪比为9.04dB。经验证实验，获得GDL产量为2.65g/L，信噪比为9.68dB，验证值比较接近预测值，说明此优化方案达到了预期的优化效果，且具有较好的稳定性。

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Optim ization of culture medium forγ-decalactone production by Yarrow ia sp.using Taguchidesign

ZHAO Yu-ping1，2，XU Yan1，*，ZHU Chun2
（1.Center of Brewing Science and Enzyme Technology，School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；
2.School of Life Science and Chemical Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003，China）

Culture medium forγ-decalacton p roduc tion by Yarrow ia sp.was op tim ized by using Taguchi design.First，sing le factor was tested，then orthogonal experiment was designed to carry out using Minitab software，and the result of the mean and SNR of level of each factor were analyzed by using Taguchi design. The result p roved that the effec t of com posite nitrogen was very significant，and（NH4）2HPO4was significant. Software p red icted the op timal culture medium consisted of 20g/L wheat b ran，7.5g/L yeast extrac t，16.5g/L（NH4）2HPO4，6g/L KH2PO4and 0.5g/LMgSO4·7H2O，and GDL yield was 2.49g/L，the SNR was 9.04dB.Theγdecalacton yield of verification experiment was 2.65g/L，and the SNR was 9.68dB.The result showed that the op timalsolution achieved the desired effectw ith good stability.

γ-decalactone；Yarrow ia sp.；Taguchidesign；med ium op tim ization

TS201.3

B

1002-0306（2012）20-0326-05

2012－05－24 *通讯联系人

赵玉萍（1977-），女，博士研究生，副教授，研究方向：生物技术。

江苏省科技支撑计划（BE2012111）；淮安市工业科技计划（HAG09040）。