高同型半胱氨酸血症对平滑肌细胞的氧化损伤

李 燕 张春来 卢 峰 王立忠 姜玉凤

(河北唐山工人医院心内4科，唐山 063000)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，是甲硫氨酸(又称蛋氨酸)的中间代谢产物。同型半胱氨酸血症与许多疾病有关，血中Hcy升高可致流产、新生儿缺陷直至中风、老年性痴呆及其他老年性疾病如骨质疏松等，尤其被认为Hcy升高是冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)的一个独立危险因素［1-2］。高同型半胱氨酸血症可能与Hcy代谢有关的酶和维生素缺乏有关。近年来，大量研究［1］表明同型半胱氨酸是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的一个新的、重要的独立危险因子，然而其致AS的机制尚未完全阐明。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的迁移和增生是导致血管内膜增厚及粥样斑块形成的关键。现在关于Hcy致AS机制的研究大都在离体血管内皮细胞或离体的平滑肌细胞株上完成，所使用的Hcy的浓度往往高出机体实际水平的数倍或数十倍，而Hcy对活体动物血管平滑肌细胞的氧化、增生的影响却少见报道。因此，本研究用不同剂量高Hcy饲料饲喂新西兰大白兔，观察Hcy对兔颈动脉平滑肌细胞氧化损伤与增生的影响，进而探讨Hcy引起AS的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制备

40只新西兰兔购自河北医科大学实验动物中心〔动物许可证号:SYXK(冀)2007-0049〕，普通饲料适应性喂养1周后;用数字表法随机分组分为5组，每组8只，模型1组为对照(control，C)组，饲喂不含蛋氨酸的普通饲料;第2组为模型1(model 1，M1)组，饲喂含2%蛋氨酸、6%花生油和92%普通颗粒饲料的高蛋氨酸饲料;第3组为模型2组(model 2，M2)，饲喂含4%蛋氨酸、6%花生油和90%普通颗粒饲料的高蛋氨酸饲料;第4组为模型3组(model 3，M3)，饲喂含6%蛋氨酸、6%花生油和88%普通颗粒饲料的高蛋氨酸饲料;第5组为模型4组(model 4，M4)，饲喂含10%蛋氨酸、6%花生油和84%普通颗粒饲料的高蛋氨酸饲料;饲喂8周后，每周定点抽取静脉血，共采血5次，分别测Hcy浓度。喂养3个月至颈动脉粥样硬化性狭窄模型建立。

1.2 兔颈动脉内膜平滑肌分离

喂养3个月后，新西兰兔手术当日清晨禁水禁食，称体质量，肌肉注射速眠新注射液(0.1 mL/kg)麻醉。取其颈部正中皮肤切口，切开皮下组织，正中剪开颈阔肌，沿胸锁乳突肌内侧缘向深部游离显露颈总动脉。在显微镜下操作，剪开动脉鞘，将颈动脉与迷走神经分离，可见病变血管壁较周围增厚，颜色变黄，血管下垫乳胶橡皮片。动脉壁滴2滴1%的利多卡因防止痉挛，完全游离出病变段动脉并以动脉夹将其孤立，长8～12 mm，于管壁前方以尖刀作纵行切口，用纤维剪延长。肝素盐水冲洗管腔，在切缘处用纤维镊，纤维剥离分离出粥样斑块与血管中膜的界限并向管径周围扩展，直至与对侧切缘会合，然后将整个斑块向远端分离，剥除斑块远端后，将斑块提起向近端分离，直至取出整个斑块，防止形成漂浮瓣。

1.3 兔颈动脉组织学及病理形态学观察

剪取约0.5 cm颈动脉，10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm连续切片。冷冻切片先用电吹风吹干，经快速固定后水洗，苏木素染液染色10 min。自来水冲洗5 min。0.5%盐酸乙醇溶液分化数秒钟。自来水冲洗。温热水5 min或弱碱性溶液30 s显蓝。自来水充分冲洗。伊红复染2 min。95%乙醇和100%乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片，显微镜下观察。

1.4 兔颈动脉平滑肌原代细胞培养

将分离的各实验组颈动脉壁用D-Hanks液清洗，去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成小块，移入青霉素小瓶中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪反复剪切组织，直到组织成糊状，约1 mm3大小。静置片刻后用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。将已剪切好的组织块加入3倍的0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化3 min，静置待组织块沉淀后，弃去上清液，加入新鲜胰蛋白酶溶液;37℃消化10 min，收集上层消化液;加入新的酶溶液，直至组织基本消化完毕，收集的消化液立即加入Hanks液，以800 r/min，离心5 min，收集细胞沉淀，加入含20%小牛血清培养液少许，轻轻打散细胞沉淀，制成细胞悬液。将收集的酶-细胞悬液移入离心管，加入小牛血清至10%，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。以生长液悬浮并调细胞数至5×105/mL，静置37℃培养。24 h贴壁展平。7 d后长满瓶壁，可以进行传代，用于检测SOD及CAT活性。

1.5 血浆Hcy浓度测定

应用日立7170A全自动生化分析仪(日本日立公司产品)测定各实验组血浆Hcy浓度，分别计算各实验动物5次结果的平均值，作为各实验动物血浆Hcy浓度，并以此计算各组血浆Hcy浓度的平均值及标准差，进行统计学分析。

1.6 SOD活性测定

用刮刀刮下细胞，4℃下，2 000 r/min离心10 min，弃上清。用1 mL PBS清洗细胞，4℃，2 000 r/min离心10 min，弃上清。重复此步骤一次。用匀浆器将细胞破损，加入1 mL新的PBS，在冰浴器上用超声降解细胞裂解物(60 W，0.5 s间隔，15 min)。4℃下，10 000 g离心15 min，移出上清液并用PBS稀释，制成样品溶液。样品孔和空白孔2中分别加入20 μL样品溶液，在空白孔1和空白孔3中分别加入20 mL ddH2O(双蒸水)。每孔分别加入200μL WST工作液，混匀。空白孔2和空白孔3中分别加入20 μL Dilution buffer。样品孔和空白孔1中分别加入20 μL酶工作液，充分混合。37℃ CO2培养箱中培养20 min。用酶标仪在450 nm处读数。计算SOD的活性(抑制率%)。

1.7 CAT 含量测定

将收集于血清分离管的全血标本在室温放置30 min，然后1 000 r/min离心20 min，取上清即可检测。分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100 μL不同浓度的标准品。空白孔加100 μL蒸馏水，余孔加待测样品100 μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2 h。弃去液体，甩干。每孔加检测溶液A工作液100 μL，酶标板加上覆膜，37℃ 温育1 h。弃去孔内液体，每孔用400 μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2 min，甩干，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。每孔加检测溶液B工作液100 μL，加上覆膜，37℃ 温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色。反应时间25 min。每孔加终止溶液50 μL。终止反应，此时蓝色立刻转变为黄色。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪(中国北京科大创新股份有限公司)在450 nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与值计算出标准曲线的回归方程式，测定样品的实际浓度。

1.8 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS 10.0进行统计处理。实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异采用one-way ANOVA分析检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血浆HCY浓度比较

各组动物饲喂8周后，每周抽取动物血浆，共5次，将5次血浆测取Hcy浓度，取5次平均值得到如下结果，见表1。

表1 实验各组血浆Hcy浓度Tab.1 Hcy concentrations of plasma of each group(¯x ± s) (n=8)

2.2 各组颈动脉平滑肌细胞内CAT的含量比较

在高蛋氨酸饮食作用下，兔颈动脉平滑肌细胞内CAT的含量明显增高，各模型组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表2。

表2 各实验组CAT的含量Tab.2 CAT density of rabbit carotid artery smooth muscle cells(¯x ± s) (n=8)

2.3 各组颈动脉平滑肌细胞内SOD的活性比较

在高蛋氨酸饮食作用下，在较低饲喂浓度颈动脉平滑肌细胞内SOD的活性已有所增高，在较高饲喂浓度下SOD的活性明显增高。各蛋氨酸饮食组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 各实验组SOD的活性Tab.3 The SOD activity of rabbit carotid artery smooth muscle cells in groups(±s)(n=8)

表3 各实验组SOD的活性Tab.3 The SOD activity of rabbit carotid artery smooth muscle cells in groups(±s)(n=8)

SOD:superoxide dismutase;* P ＜0.01 vs control.

Group SOD density/(U·mL－1)Control 105.20 ±1.75 Model 1 118.42 ±1.88*Model 2 133.71 ±1.96*Model 3 148.69 ±2.06*Model 4 158.95 ±1.75*

3 讨论

动脉粥样硬化是血管内膜形成粥样斑块，并引起管腔狭窄甚至闭塞的病理生理过程;内皮细胞损伤、平滑肌细胞增生、血小板激活、凝血与纤溶系统失衡是其主要发病机制［3］。同型半胱氨酸是一种含硫基的4碳α-氨基酸也是一种反应性血管损伤氨基酸。其首次由 Vigneaud Du［4］在1932年发现。本研究结果显示，在Hcy作用下，血管平滑肌细胞内SOD和CAT的活性明显升高。近年大量的研究［5-7］表明，血中Hcy水平升高是动脉粥样硬化发病的一个新的独立的危险因素。SOD和CAT为体内活性氧的清除剂。SOD可催化 O2－，生成 H2O2，H2O2在 CAT作用下生成H2O，从而消除自由基的毒性作用。

本研究通过制备高同型半胱氨酸动物模型来模拟临床的病理变化。制作动物模型的本身存在一定的局限性，不可能完全复制临床病理变化。

本研究结果显示，高蛋氨酸饲喂组VSMC细胞内SOD的活性有明显增加，提示一定浓度的Hcy可促使VSMC内活性氧生成。而随着饲喂蛋氨酸浓度的升高，SOD和CAT活性显著增高，说明高浓度Hcy作用下活性氧增多显著，SOD和CAT活性的增高虽可拮抗活性氧的作用，但VSMC内脂质过氧化反应明显，Hcy诱发VSMC出现了明显的氧化损伤，这一作用可能也参与了高Hcy致动脉粥样硬化的发生和发展过程。

有关高同型半胱氨酸致病的机制尚不完全清楚，有资料显示［5-7］高同型半胱氨酸是血管损伤性氨基酸，可直接造成血管内皮细胞损伤和血管功能异常。虽然过量胆固醇沉积是造成动脉壁损伤的直接原因，但是临床上胆固醇的水平并不能作为动脉粥样硬化疾病的指标，这是因为胆固醇在动脉壁的堆积与多种脂蛋白，尤其是低密度脂蛋白和高密度脂蛋白有着密切的联系。根据研究［8］，如果当体内同型半胱氨酸代谢紊乱，浓度升高，就会形成同型半胱氨酸巯基内酯，可与低密度脂蛋白形成复合体，随后被巨噬细胞吞噬，形成堆积动脉粥样硬化斑块上的泡沫细胞。而且，同型半胱氨酸还可自发氧化，形成超氧化物和过氧化氢，这些产物会导致内皮细胞的损伤和低密度脂蛋白的氧化，并可造成血管平滑肌持续性的收缩，引起缺氧，从而加速动脉粥样硬化的过程。不仅如此，同型半胱氨酸自发形成的巯基内酯化合物，可以和反式视黄酸共同引起血小板的凝集，与此同时，同型半胱氨酸巯基内酯还可引起血栓素以及PGF1αR的形成。这样就会促进血凝块的形成，从而引起临床上常见的梗死性疾病，这在动物实验［9-10］中也得到了验证。当然，同型半胱氨酸还可通过其他一些途径诱发心血管疾病。它可诱导血管平滑肌细胞中新的mRNA的形成，使动脉壁平滑肌细胞增生，并造成动脉内皮细胞的脱落，加速粥样硬化的过程。另外，由于S腺苷同型半胱氨酸是依赖S腺苷蛋氨酸的甲基化反应潜在的抑制物，所以同型半胱氨酸浓度的升高，会影响体内许多物质的甲基化过程，从而影响机体的正常代谢［11］。

总之，同型半胱氨酸可加速动脉血管壁平滑肌细胞粥样硬化的进程。对于临床高血压、冠心病及脑血管疾病的人群，及时检测血浆Hcy水平，有利于寻找病因，对于高同型半胱氨酸血症的患者积极采取有效措施，通过补充维生素B12、叶酸等可降低Hcy水平，对防病治病有积极的作用。

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