他克莫司对大鼠肾缺血再灌注保护作用的研究

武 飞 刘致中

(1.乌兰察布市中心医院泌尿外科，乌兰察布 012000;2.内蒙古医学院第三附属医院泌尿外科，包头 014000)

缺血再灌注损伤是肾脏移植中不可避免的病理过程，轻者导致肾功能延迟恢复，重者造成肾功能衰竭，影响移植肾和患者的长期存活。如何减轻肾移植过程中的缺血再灌注损伤是一个重要的研究领域。目前虽然有多种药物和治疗手段运用于改善肾缺血再灌注损伤，但是缺乏特异性。有研究者发现［1］一些新型免疫抑制药物在使用过程中，具有改善肾缺血再灌注损伤的特性，而且能够使损伤后的肾脏得到一定程度的修复和再生。他克莫司是目前用于器官移植后抗排异反应的新型免疫抑制药物。为了证实他克莫司改善肾脏缺血再灌注损伤的作用。本实验建立大鼠缺血再灌注模型，研究他克莫司对大鼠肾缺血再灌注的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

大鼠TNF-α试剂盒(ELISA)(美国);Bcl-2蛋白单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司);SP免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);他克莫司注射液(由藤泽制药有限公司惠赠)。

1.2 实验动物及分组

选用健康雄性Wistar大鼠60只(购自内蒙古大学动物实验中心)，体质量220～260 g。采用抽签法随机分成3组(每组20只):假手术组、对照组、实验组。每组按再灌注时间分为4组，再灌注分别为0.5、2、6、24 h，每组5 只。

1.3 动物模型建立

所有动物实验前禁食12 h，自由饮水，对大鼠注射20%乌拉坦(5 mL/kg)行腹腔麻醉后，沿腹部正中切口进腹，切除右肾，分离左肾动脉，用无创动脉夹夹闭左肾动脉，45 min后移走无创动脉夹恢复灌注，肾脏由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功，缝合切口。假手术组仅作麻醉、开腹、行右肾切除术，并分离左肾动脉，不阻断肾动脉血供，只做操作而不给药。对照组建立肾缺血再灌注模型，于手术前6 h从尾静脉注射0.9%氯化钠注射液1 mL/kg。实验组建立肾缺血再灌注模型，于手术前6 h从尾静脉注射0.2 g/L的他克莫司注射液(0.5 mg/kg)。每组在到达再灌注时间点分别再次麻醉，打开腹腔取血及肾脏标本，整个手术过程均保持无菌操作。

1.4 观察指标

肌酣(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)用全自动生化分析仪测定。将组织进行HE染色后用光学显微镜观察肾组织形态学变化。用酶联免疫吸附法(ELISA法)测血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)含量。用免疫组化技术测定肾组织Bcl-2蛋白，其阳性结果判定:Bcl－2阳性反应结果为胞质内呈棕黄色染色，不着色者为阴性。在高倍镜下(400×)，每片随机取5个视野，每个视野计100个细胞，计算阳性细胞数，阳性细胞数为0，记作(－)，阳性细胞数25%以下为(+)，25% ～50%为(++)，51% ～75% 为(+++)，75% 以上为(++++)，并将反应强度评分，“+”为1分，“++”为2分，“+++”为3分，“++++”为4分［2］。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计分析软件进行分析，所得实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点两组大鼠Cr、BUN的变化

对照组大鼠在肾缺血再灌注的0.5 h、2 h、6 h及24 h，随着再灌注时间的延长，Cr、BUN明显升高。实验组大鼠在肾缺血再灌注的0.5 h、2 h及6 h，随着再灌注时间的延长，Cr、BUN升高不明显，而在再灌注24 h时，Cr、BUN不再升高，反而明显降低。在肾缺血再灌注2 h、6 h和24 h时，实验组和对照组的 Cr、BUN差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表1。

表1 3组大鼠各再灌注时间点的Cr、BUN比较Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

表1 3组大鼠各再灌注时间点的Cr、BUN比较Tab.1 Comparison of the Cr and BUN among three groups(±s)μmol/L

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P＜0.05 vs control group;Cr:creatinine;BUN:blood urea nitrogen.

Group Number of case Cr 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 30.50 ±5.31 33.76 ±7.12 39.44 ±7.46 43.32 ±8.61 Control group 20 50.90 ±7.09 76.08 ±4.59 98.38 ±11.43* 156.18 ±64.25*Experimental group 20 53.38 ±2.39* 60.62 ±2.88＊△ 75.10 ±17.28＊△ 51.30 ±6.47△Group Number of case BUN 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 8.76 ±1.46 10.34 ±2.2115.65 ±3.75 14.42 ±3.68 Control group 20 13.38 ±2.00 20.33 ±1.98* 26.21 ±3.28* 44.26 ±3.15 Experimental group 20 12.16 ±0.95* 14.75 ±0.63△ 19.72 ±2.44＊△ 15.29 ±3.39△

2.2 血清TNF-α 的变化

对照组在再灌注各时间点随着再灌注时间的延长，TNF-α含量明显的升高。实验组在再灌注0.5 h、2 h及6 h，随着再灌注时间的延长，TNF-α含量升高不明显，而在再灌注24 h时，TNF-α含量出现了降低。在再灌注的各时间点，实验组和对照组TNF-α含量差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表2。

2.3 免疫组化检测肾组织Bcl-2的表达

各组大鼠肾组织中均有Bcl-2表达，主要在肾的远曲小管、近曲小管表达，但免疫反应强度不同(图1)。实验组和对照组在再灌注2 h、6 h、24 h的Bcl-2免疫反应强度差异有统计学意义(P＜0.05)。假手术组的Bcl-2免疫反应强度在2 h、6 h与实验组和对照组的差异均有统计学意义(P＜0.05)，详见表3。

表2 3组大鼠各再灌注时间点的TNF-α比较Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

表2 3组大鼠各再灌注时间点的TNF-α比较Tab.2 Comparison of the TNF-α among three groups(±s)pg/mL

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs Control group;TNF:tumor necrosis factor.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 1.51 ±0.69 1.62 ±0.49 1.86 ±0.79 2.31 ±1.07 Control group 20 4.81 ±1.25 5.02 ±1.47 7.94 ±2.22 15.16 ±3.65 Experimental group 20 1.95 ±0.73＊△ 3.04 ±0.48＊△ 3.94 ±2.39△ 3.31 ±1.64＊△

图1 各组大鼠肾组织缺血再灌注24 h Bcl-2蛋白表达Fig.1 Bcl-2 protein expression of the kidney in ischemia reperfusion 24 h of three group(400×)A:Control group;B:experimental group;C:shame operation group.

表3 3组大鼠各再灌注时间点的Bcl-2反应强度比较Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

表3 3组大鼠各再灌注时间点的Bcl-2反应强度比较Tab.3 Comparison of the Bcl-2 among three groups(±s)

* P ＜0.05 vs sham operation group;△ P ＜0.05 vs control group;Bcl:B cell lymphoma.

Group Number of case 0.5 h 2 h 6 h 24 h Sham operation group 20 3.00 ±0.71 3.60 ±0.55 2.60 ±0.55 2.20 ±0.45 Control group 20 2.20 ±0.45 1.80 ±0.45* 1.20 ±0.45* 1.40 ±0.55 Experimental group 20 2.60 ±0.55 2.60 ±0.55＊△ 2.00 ±0.00＊△ 3.20 ±0.84＊△

2.4 肾组织的病理变化

在光镜下，对照组在再灌注各时间点均出现肾小管扩张，肾小管上皮细胞明显肿胀、空泡变性，间质血管扩张充血，而在再灌注的6 h、24 h可见肾小管上皮细胞扁平、脱落，基底膜裸露。实验组在再灌注的各时间点，肾小管及肾小管上皮细胞病变程度较对照组明显减轻，而假手术组未见明显改变(图2)。

图2 两组大鼠肾组织缺血再灌注24 h病理变化Fig.2 Changes of histopathology in the ischemia reperfusion 24 h of the two group(400×)

3 讨论

肾脏是对缺血再灌注损伤非常敏感的器官之一，其损伤机制十分复杂，与氧自由基所致的脂质过氧化损伤、肾血管内皮细胞生成和释放的舒张与收缩因子失调等因素有关［3］。目前有多种药物和治疗手段运用于改善肾缺血再灌注损伤，他克莫司是新型免疫抑制药物，在使用中发现具有改善缺血再灌注损伤的特性。他克莫司是一个钙调磷蛋白磷酸酶抑制剂，可与T细胞胞质内的钙离子-钙调蛋白依赖性磷酯酶活性蛋白结合，阻断磷酯酶活性和钙离子内流，使NF-AT途径转录IL-2失活，从而抑制T细胞的活化，并可通过下调FAS和上调Bcl-2使移植肝脏产生抗凋亡作用［4］。赵伟等［5］通过他克莫司药液对离体肾脏的浸泡研究，发现通过Bcl-2蛋白、Bcl-2 mRNA的表达增加，抑制肾细胞的凋亡，对离体肾起到保护作用。有文献［6］报道，他克莫司可通过减少多种细胞因子如TNF-α、IL-1和自由基的生成;通过降低中性粒细胞的聚集和细胞黏附分子的合成来减轻缺血再灌注损伤，这种保护作用已在多种脏器中得到证实。

本文是通过活体注射他克莫司，然后建立肾缺血再灌注损伤模型，实验结果显示Bcl-2蛋白主要在肾的远曲小管、近曲小管表达，通过增加Bcl-2蛋白的表达来抑制肾细胞的凋亡，保护肾细胞缺血再灌注损伤，也证明了在肾脏组织缺血之前给予他克莫司能够降低TNF-α的浓度，从而减轻肾脏的缺血再灌注损伤。本实验结果也显示，在肾脏缺血前6 h给予他克莫司药物，行肾缺血再灌注，在再灌注的时间段里，发现在再灌注的24 h肾小管，肾小管上皮细胞病变程度减轻明显，肾组织中Bcl-2表达明显增加，肾功能明显改善。

王东等［7］在脂肪肝供体大鼠肝移植模型中观察到，使用他克莫司可降低移植物脂质过氧化程度，保护肝细胞内超微结构，对脂肪肝供体移植物功能具有保护作用。因此根据本实验结果预测:在活体肾移植中，供肾者手术前6 h口服他克莫司，减轻肾缺血再灌注损伤，取出的肾植于受者，有利于受者肾功能恢复。为了移植肾术后早期功能的恢复，已有多种药物和治疗手段来减轻肾缺血再灌注损伤，因此对肾缺血再灌注损伤的防治还需更深入的研究。

［1］Garcia-Criado FJ，Lozano-Sanchez F，Fernandez-Regalado J，et al.Possible tacrolimus action mechanisms in its protector effects on ischemia-reperfusion injury［J］.Transplantation，1998，66(7):942-943.

［2］石群立，张泰和，钱澄源，等.原发性中枢神经系统淋巴瘤Bcl-2蛋白的表达［J］.中华病理学杂志，1996，25(3):171.

［3］Kowaltowski A J，Smaili S S，Russell J T，et al.Elevation of resting mitochondrial membrane potential of neural cells by cyclosporin A BAPTA-Am and bcl-2［J］.Am J Physiol Cell Physio1，2000，279(3):852-859.

［4］Moriuchi H，Kamohara Y，Eguchi S，et al.Diverse effects of FK506 on the apoptosis of hepatocytes and infiltrating glymphocytes in an allografted rat liver［J］.J Surg Res，2011，167(1):131-139.

［5］赵伟，王卫国，邵鼓，等.FK506对大鼠离体肾细胞凋亡及bcl-2蛋白、bcl-2 mRNA表达的影响［J］.中华实验外科杂志，2006，23(4):596-597.

［6］Laurens M，Scozzari G，Patrono D，et al.Warm ischemiareperfusion injury is decreased by tacrolimus in steatotic rat liver［J］.Liver transpl，2006，12(2):217-225.

［7］王东，朱继业，栗光明，等.他克莫司对脂肪肝供体大鼠肝移植围手术期移植物功能保护作用的研究［J］.器官移植，2010，1(1):11-12.