HPLC法同时测定阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯铵的含量

2012-10-25刘葵葵

药学研究 2012年12期

张琳，刘葵葵，王伶

(山东省医疗器械研究所，山东省医用高分子材料重点实验室，山东济南250100)

阿奇霉素是15元环大环内酯类抗生素，具有较广的抗菌谱，体外试验证明阿奇霉素对临床上多种常见致病菌有抗菌作用。2007年4月底，美国FDA批准英斯皮雷制药(Inspire Pharmaceuticals)公司的1%阿齐霉素滴眼液(商品名:AzaSite)上市，用于治疗细菌性结膜炎。阿奇霉素滴眼液为非单剂量包装的滴眼液，因此其中添加了苯扎氯铵作为防腐剂，为了保证防腐剂的安全性及抑菌效用，需要对其含量进行控制。本文建立了一种有效的HPLC方法，可同时测定阿奇霉素及苯扎氯铵的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(G1314A VWD检测器，Agilent 1100液相色谱化学工作站，美国，Agilent公司)

1.2 试药阿奇霉素滴眼液，本单位制备(批号:0901141、0901142、0901143);阿奇霉素，上海现代制药股份(071004);阿奇霉素对照品，中国药品生物制品检定所(130593－200901);苯扎氯铵对照品，北京京广化工有限公司(20050603);甲醇、乙腈为色谱纯，水为三次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件以高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)进行测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱型号:CAPCELL PAK C18MGⅡ，4.6 mm ×150 mm，5μm)，柱温 30 ℃，以磷酸盐缓冲液(取 0.05 mol·L－1磷酸氢二钾溶液，用20%磷酸调节溶液的pH至8.2)－乙腈(58∶42)为流动相;检测波长 210 nm，流速:1.0 mL·min－1，进样体积为 20 μL［1，3］。

2.2 溶液制备

2.2.1 枸橼酸盐缓冲溶液的制备精密称取枸橼酸钠5.0 g及枸橼酸5.0 g，加水1 000 mL使溶解，即得。

2.2.2 阿奇霉素对照品溶液的制备精密称取阿奇霉素对照品30.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为阿奇霉素对照品溶液。

2.2.3 苯扎氯铵对照品溶液的制备精密称取苯扎氯铵对照品18.0 mg，置100 mL量瓶中，加枸橼酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，精密量取0.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为苯扎氯铵对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备精密称取供试品3.0 g，置10 mL量瓶中，精密称定，加0.06 g的氯化钠，振摇使氯化钠溶解，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，3 000 r·min－1离心20 min，取上层澄清液作为供试品溶液。

2.2.5 空白基质溶液的制备精密称取不含阿奇霉素及苯扎氯铵的空白基质3.0 g，加入0.06 g氯化钠，强力振摇2 min，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，3 000 r·min－1离心20 min，取上层澄清液作为空白基质溶液。

3 方法验证［2］

3.1 专属性试验精密量取甲醇、枸橼酸盐缓冲液、空白基质溶液及上述各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，在上述色谱条件下，溶剂及空白基质在阿奇霉素及苯扎氯铵出峰位置无干扰，供试品溶液中苯扎氯铵及阿奇霉素分离度为6.78，分离度符合要求。

图1 供试品溶液HPLC图谱

3.2 定量限测定

3.2.1 阿奇霉素定量限测定精密称取阿奇霉素对照品30.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，再分别稀释2 000～10 000倍不等，照上述色谱条件进行测定，测得阿奇霉素定量限约为750 ng·mL－1(S/N=10)。

3.2.2 苯扎氯铵定量限测定取苯扎氯铵对照品9.20 mg，置100 mL量瓶中，加枸橼酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，再分别稀释100～5 000倍不等，按上述色谱条件进行测定，20 μL进样，测得阿奇霉素定量限约为46 ng·mL－1(S/N=10)。

3.3 线性与范围

3.3.1 阿奇霉素的线性与范围精密称取阿奇霉素对照品0.250 7 g，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取上述各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图，试验结果见表1。

表1 阿奇霉素的线性关系表

以阿奇霉素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得线性回归方程为:A=1 672.6C+22.745，R2=0.999 9，n=5。阿奇霉素在 1.002 8 ～5.014 0 mg·mL－1浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好。

3.3.2 苯扎氯铵的线性与范围精密称取苯扎氯铵0.020 5 g，置50 mL量瓶中，加枸橼酸盐缓冲液(称取0.5 g的枸橼酸和0.5 g的枸橼酸钠，加水溶解并稀释至100 mL)溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液 3、4、5、6、7 mL，分别置200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取各溶液20μL注入色谱仪，记录色谱图，结果见表2。

表2 苯扎氯铵的线性关系表

以苯扎氯铵浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得线性回归方程为:A=27.907C －21.24，R2=0.999 3，n=5。苯扎氯铵在6.15 ～14.35 μg·mL－1浓度范围内，浓度与峰面积线性关系良好。

3.3.3 方法的重复性取阿奇霉素滴眼液3.0 g(约含阿奇霉素30 mg)，置10 mL量瓶中，加入0.06 g氯化钠，强力振摇2 min，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，在3 000 r·min－1下离心20 min，取上层澄清液作为供试品溶液，平行制备6份;精密称取阿奇霉素对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每

1 mL中约含阿奇霉素3 mg的溶液，作为阿奇霉素对照品溶液;取苯扎氯铵对照品适量，加枸橼酸盐缓冲液溶解并稀释制成每1 mL中约含苯扎氯铵0.18 mg的溶液，加甲醇定量稀释制成每1 mL中约含苯扎氯铵9 μg的溶液，作为苯扎氯铵对照品溶液。分别精密量取上述各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图，外标法以峰面积计算阿奇霉素及苯扎氯铵的含量，结果见表3。

表3 阿奇霉素及苯扎氯铵含量测定的方法重复性试验结果

由上述结果可知，6平行样品中阿奇霉素的平均含量为106.94%，RSD 为0.94%，苯扎氯铵的平均含量为100.04%，RSD为0.67%，证明本方法用于同时测定两种成分含量的方法重复性良好。

3.3.4 仪器的重复性取方法重复性项下样品1供试品溶液，连续进样6针，记录色谱图，结果见表4。

表4 阿奇霉素及苯扎氯铵含量测定的仪器重复性试验结果

由试验结果可知，阿奇霉素的平均含量为106.94%，RSD为0.57%，苯扎氯铵的平均含量为101.24，RSD 为1.52%，证明本仪器用于测定两种物质含量的重复性良好。

3.3.5 供试品溶液的稳定性试验取方法重复性项下供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8 h 取 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表5。

表5 阿奇霉素及苯扎氯铵含量测定供试品溶液稳定性试验

由试验结果可知，阿奇霉素的平均含量为106.74%，RSD为0.51%，苯扎氯铵的平均含量为99.90%，RSD为0.56%，证明各时间点供试品溶液中阿奇霉素及苯扎氯铵的峰面积变化均较小，说明供试品溶液在8 h内的稳定性良好。

3.3.6 回收率试验

3.3.6.1 阿奇霉素的回收率试验取空白基质约3.0g，精密称定，置10 mL量瓶中，加入处方量80%、100%、120%的阿奇霉素原料，每个比例平行称取3份样品;另称取0.06 g左右的氯化钠于各样品中，振摇使其溶解，加甲醇稀释至刻度，置3 000 r·min－1下离心20 min，取上层澄清液作为阿奇霉素回收率样品。精密量取上述各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图。另取阿奇霉素对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含3 mg的溶液，作为阿奇霉素对照品溶液，同法测定，结果见表7。

表7 阿奇霉素含量测定回收率试验

由试验结果可知，阿奇霉素平均回收率为100.68%，RSD为0.50%，说明该方法可以满足阿奇霉素的含量测定要求。

3.3.6.2 苯扎氯铵的回收率试验称取不含苯扎氯铵的样品约3 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加入处方量80%、100%、120%的苯扎氯铵，每个比例平行称取3份样品;另称取0.06 g的氯化钠于样品中，振摇使其溶解，用甲醇稀释至刻度，置3 000 r·min－1下离心20 min，取上层澄清液作为苯扎氯铵回收率的样品。分别精密量取各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图。另取苯扎氯铵对照品适量，加枸橼酸盐缓冲液溶解并稀释制成每1 mL中约含苯扎氯铵0.18 mg的溶液，再用甲醇定量稀释制成每1 mL中约含苯扎氯铵9 μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定，结果见表8。