姜料中抗坏血酸克吕沃尔菌特性及其产生亚硝酸盐能力研究

赖晓芳，兰全学，杨 俊，陈血建，肖仕伟，陈 晶，杨国武

(深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518131)

姜料中抗坏血酸克吕沃尔菌特性及其产生亚硝酸盐能力研究

赖晓芳，兰全学，杨 俊，陈血建，肖仕伟，陈 晶，杨国武*

(深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518131)

目的:研究从姜料分离的抗坏血酸克吕沃尔菌生理生化特性，及其在姜料中产生亚硝酸盐的能力，分析即用姜料产生亚硝酸盐的原因及规律。方法:进行抗坏血酸克吕沃尔菌生化实验，观察该菌在不同冷藏温度、氯化钠浓度和pH的生长情况，用该菌污染姜料后分析姜料的亚硝酸盐变化规律。结果:抗坏血酸克吕沃尔菌硝酸盐还原实验阳性;在1、4℃培养时会逐渐减少直至全部死亡，在8℃会缓慢生长;氯化钠浓度为1%和2%的培养基适合其繁殖;在pH4.0的培养基中会逐步死亡，pH5.0、6.0适合其繁殖;姜料中抗坏血酸克吕沃尔菌总数增长到108CFU/g时，多数姜料中亚硝酸盐含量达到峰值。结论:抗坏血酸克吕沃尔菌具有硝酸盐还原能力，在4℃以下不会生长繁殖，其生长的适宜氯化钠浓度为1%～2%，适宜pH为5.0～6.0，抗坏血酸克吕沃尔菌的大量繁殖可以导致姜料中亚硝酸盐大量产生。

抗坏血酸克吕沃尔菌，生理生化特性，亚硝酸盐

有文献指出，蔬菜存放过程中产生亚硝酸盐，是由于硝酸盐还原细菌大量繁殖将硝酸盐还原为亚硝酸盐所致［1－2］，但具体由哪些细菌引起，尚未见到相关报道。克吕沃尔菌属在1981年由Farmer等正式确认，属于肠杆菌科，包括抗坏血酸、栖冷、佐治亚、蜗牛克吕沃尔菌4个种，可存在于食物、土壤和污水中［3］。目前，国内外只有极少量的关于克吕沃尔菌引起临床感染病例的报道，未见到关于抗坏血酸克吕沃尔菌生理生化特性以及其引起蔬菜中亚硝酸盐大量积聚的报道［4－7］。1～10℃是蔬菜在许多家庭和餐饮服务企业常见的冷藏温度［8－9］，分析抗坏血酸克吕沃尔菌在不同冷藏温度的生长特性，对于预防和控制蔬菜中亚硝盐的产生具有重要指导意义。本研究以从即用嫩姜姜蓉(亚硝酸盐含量高达160mg/kg (以N计))中分离的一株抗坏血酸克吕沃尔菌作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

抗坏血酸克吕沃尔菌 从一份即用嫩姜姜蓉(亚硝酸盐含量160mg/kg，以N计)分离;营养肉汤、平板计数琼脂 北京陆桥技术有限责任公司;硝酸盐、亚硝酸盐快速测定试剂条(反应垫上为固体格利斯试剂对氨基苯磺酰胺和N－1萘基乙二胺) 美国Industrial Test Systems公司。

表1 抗坏血酸克吕沃尔菌生化反应结果Table 1 Biochemical reaction of Kluyveraascorbata

VITEK2 Compact全自动微生物鉴定仪、Vitek2 GN鉴定卡 法国生物梅里埃公司;SHP－250生化培养箱 中国上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗坏血酸克吕沃尔菌的分离 以一份亚硝酸盐含量为160mg/kg的仔姜姜蓉为材料，分别涂布血平板、普通琼脂平板，在需氧、微需氧、厌氧条件下37℃进行细菌分离培养，在各培养条件下得到的两种平板上长出的菌落形态和菌落分布相似。通过对各种菌落的纯化培养和生化鉴定，鉴定出在姜蓉中数量上占绝对优势的细菌为抗坏血酸克吕沃尔菌。

1.2.2 抗坏血酸克吕沃尔菌的生化特性分析 将菌株革兰氏染色，用全自动微生物鉴定仪VITEK 2 Compact进行生化鉴定。将抗坏血酸吕沃尔菌接种于硝酸盐肉汤生化管中，37℃培养24h，加入硝酸盐还原甲、乙液，观察颜色变化，检测该菌的硝酸盐还原能力。

1.2.3 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同冷藏温度的生长特性 培养液为营养肉汤(pH7.0)，将初始浓度为102、104、106CFU/m L的抗坏血酸克吕沃尔菌培养基分别置于1、4、8℃条件下培养，间隔一定时间对菌液进行平板菌落计数。

1.2.4 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同盐浓度的生长特性 配制氯化钠浓度分别为0.5%、1%、2%、5%、10%、20%的营养肉汤(pH7.0)培养液，将含终浓度102CFU/m L的抗坏血酸克吕沃尔菌上述营养肉汤于8℃培养，间隔一定时间进行平板菌落计数。

1.2.5 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同pH条件下的生长特性 配制pH4.0、5.0、6.0、7.0的营养肉汤培养液，将含终浓度102CFU/m L的抗坏血酸克吕沃尔菌上述营养肉汤于8℃培养，间隔一定时间进行平板菌落计数。

1.2.6 抗坏血酸克吕沃尔菌模拟污染姜料后亚硝酸盐产生规律 将8个来源于不同产地的仔姜品种机械粉碎制成姜蓉，100℃蒸汽灭菌30min，测定8个仔姜样品的初始硝酸盐含量，分别污染终浓度为105～106CFU/g的抗坏血酸克吕沃尔菌，8个仔姜样品均设置不加细菌的对照。将上述处理过的仔姜姜蓉置于8℃条件下存放，间隔一定时间测定姜蓉中亚硝酸盐值和菌落总数。

2 结果与分析

2.1 抗坏血酸吕沃尔菌的生化特性结果

该菌在血平板和普通琼脂平板上形成圆形菌落，直径约2～3mm，灰白色、光滑、湿润、不溶血;革兰染色阴性，菌体呈杆状，无芽孢。生化反应结果见表1。菌株在有氧、厌氧情况下均可生长，为兼性厌氧菌。抗坏血酸吕沃尔菌可使硝酸盐肉汤颜色变为红色，硝酸盐还原实验阳性。

2.2 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同冷藏温度下的生长特性

培养时间为0d的细菌浓度为初始培养浓度，由表2～表4可见，102、104、106CFU/m L三种初始浓度的抗坏血酸克吕沃尔菌，在1℃和4℃培养温度不能繁殖，细菌浓度逐日减少，一段时间后该菌基本全部死亡。当菌浓度为102CFU/m L时，基本全部死亡的时间为5d;当菌浓度为104CFU/m L时，基本全部死亡的时间为7d;当菌浓度为106CFU/m L时，基本全部死亡的时间为16～26d。

当培养温度为8℃时，三种浓度抗坏血酸克吕沃尔菌均可缓慢生长，102、104、106CFU/mL菌液分别在培养第17、11、2d后达到107CFU/mL浓度，106CFU/mL菌液在培养4d后高达108CFU/m L。

表2 抗坏血酸克吕沃尔菌生长实验结果(1℃)Table 2 Growth test results of Kluyveraascorbata(1℃)

表3 抗坏血酸克吕沃尔菌生长实验结果(4℃)Table 3 Growth test results of Kluyveraascorbata(4℃)

2.3 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同盐浓度条件下的生长特性

由表5可见，初始细菌浓度为102CFU/m L的菌液(培养时间为0d)，当氯化钠浓度为0.5%时，抗坏血酸克吕沃尔菌在培养到第8d时菌浓度增加一个数量级，到第10d时浓度增加为104CFU/m L。当氯化钠浓度为1%、2%时，102CFU/m L的菌液在培养11d后浓度增加至107CFU/m L，细菌在氯化钠浓度为1%、2%条件下的繁殖速度明显快于0.5%。当氯化钠浓度为5%时，该菌培养3d后死亡。当氯化钠浓度为10%、20%时，该菌在培养1d后即死亡。

表4 抗坏血酸克吕沃尔菌生长实验结果(8℃)Table 4 Growth test results of Kluyveraascorbata(8℃)

2.4 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同pH条件下的生长特性

由表6可见，初始细菌浓度为102CFU/m L的菌液(培养时间为0d)，在pH4.0条件下培养，细菌数量迅速减少，第8d后全部死亡;在pH5.0、6.0、7.0条件下菌浓度均缓慢增加，pH5.0、6.0条件下的菌浓度增加速度快于pH7.0。

表6 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同pH环境下的生长实验结果(8℃)Table 6 Growth test results of Kluyveraascorbata in different pH(8℃)

2.5 抗坏血酸克吕沃尔菌模拟污染姜料后亚硝酸盐的产生规律

由表7～表8可见，灭菌的8个品种姜料在人工污染抗坏血酸吕沃尔菌后，在8℃放置，有7个品种姜料在3～5d内开始检出亚硝酸盐，其中黄姜的亚硝酸盐浓度在第6d高达160mg/kg(以N计)。广东大姜检出亚硝酸盐时间相对较迟，在第9d才检出。

测定亚硝酸盐的同时监测细菌数量的变化。由表7、表9可见，多数样品当菌落总数达到107CFU/g时亚硝酸盐开始检出，菌落总数为108CFU/g时，亚硝酸盐值达到峰值。未染菌的灭菌姜料在存放13d后未检出亚硝酸盐，菌落计数保持为＜10CFU/g。

表5 抗坏血酸克吕沃尔菌在不同盐浓度的生长实验结果(8℃)Table 5 Growth test results of Kluyveraascorbata in different salt concentration(8℃)

表7 不同姜料的亚硝酸盐浓度变化实验(8℃)Table 7 Nitrite concentration change of different gingermaterials(8℃)

3 结论与讨论

本研究发现抗坏血酸克吕沃尔菌可在8℃大量繁殖，并通过模拟污染实验确证了该菌可导致姜蓉产生较高浓度的亚硝酸盐。

实验结果表明，在4℃以下抗坏血酸克吕沃尔菌数量逐渐减少直至全部死亡，菌含量越少其死亡时间越短;在8℃抗坏血酸克吕沃尔菌缓慢生长，菌含量越高繁殖速度越快。因此，将蔬菜冷藏温度控制在4℃以下，可以有效抑制该菌的生长繁殖，避免大量繁殖引起的亚硝酸盐积累。

表8 不同来源仔姜姜蓉亚硝盐峰值Table 8 Nitrite concentration peak value of different gingermaterials

表9 不同姜料中菌落总数的变化实验(8℃)Table 9 Aerobic plate count of different gingermaterials(8℃)

抗血酸克吕沃尔菌在氯化钠浓度为0.5%时，初期繁殖速度较为缓慢;氯化钠浓度为1%和2%时，繁殖速度相对较快;氯化钠浓度为高于5%时，该菌不能生长。如若要腌制蔬菜，掌握好食盐浓度有利于控制抗坏血酸克吕沃尔菌大量繁殖。

抗坏血酸克吕沃尔菌在 pH4.0不能繁殖，在pH5.0～7.0可缓慢生长。本研究中的姜料pH在5.0～7.0，为该菌在姜料中大量繁殖提供了条件。蔬菜pH一般在4.0～7.0，大多数蔬菜为该菌的生长繁殖提供了适宜的pH。

模拟污染实验数据显示，抗坏血酸克吕沃尔菌可以在8℃姜料中大量繁殖，大多数姜中菌落总数从107CFU/g增长到108CFU/g时，亚硝酸盐相应从开始检出达到峰值，亚硝酸盐峰值为20～160mg/kg，没有染菌的灭菌姜样品始终不能检出亚硝酸盐。结果充分证明了由于抗坏血酸克吕沃尔菌的大量繁殖，将硝酸盐转化为亚硝酸盐，导致了姜料中大量亚硝酸盐的积聚，而且亚硝酸盐含量可以达到很高水平。本研究中未观察到姜料中初始硝酸盐浓度与亚硝酸盐峰值之间存在高低对应关系，提示细菌的繁殖情况是影响亚硝酸盐含量的关键因素。

我国膳食中80%左右的亚硝酸盐来自蔬菜［10］，控制蔬菜的亚硝酸盐含量，对保护人类健康具有重要意义。本研究结果表明，控制冷藏温度、食盐浓度可有效预防该菌在蔬菜中生长繁殖，避免亚硝酸盐的大量产生。

［1］曹会兰.亚硝酸盐对人体的危害和预防［J］.微量元素与健康研究，2003，20(2):57－58.

［2］李红，任乃林.蔬菜放置中亚硝酸盐的变化［J］.食品研究与开发，2010，33(3):205－207.

［3］侯天文，李玮，陈兴，等.自胆汁中检出栖冷克吕沃尔菌一例［J］.华北国防医药，2006，18(3):218.

［4］李红梅，颜允中.从一患者胆汁与肝内脓液及伤口分泌物中同时分离出克吕沃尔菌［J］.临床检验杂志，1995，13 (2):110.

［5］明德松.栖冷克吕沃尔菌耐药性及β－内酰胺酶检测［J］.中华医院感染学杂志，2007，17(3):342－343.

［6］Farmer J，Fanning G R，Huntley－Carter，etal.Kluyvera，a new (redefined)genus in the family Enterobacteriaceae:identification ofKluyveraascorbatasp.nov.andKluyveracryocrescenssp.nov.in clinical specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，1981，13 (5):919－933.

［7］吴寒静，宁玉华，颜秉兴.从胆汁中检出抗环血酸克吕沃菌［J］.上海医学检验杂志，1999，14(1):51.

［8］潘静娴，张艳，张莹，等.不同利用方式对几种叶菜亚硝酸盐含量的影响［J］.食品工业科技，2011，32(2):296－301.

［9］肖正华，刘元清，王刚.蔬菜在冷藏条件下亚硝酸盐含量的变化［J］.食品科技，2010，17(6):24－27.

［10］闫秋成，郭敏杰.蔬菜中硝酸盐与亚硝酸盐含量分析与评价［J］.安徽农业科学，2012，40(7):3981，4035.

Characteristics and nitrate producing capacity of Kluyvera ascorbata isolated from ginger

LAIXiao－fang，LAN Quan－xue，YANG Jun，CHEN Xue－jian，XIAO Shi－wei，CHEN Jing，YANG Guo－wu*
(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection，Shenzhen 518131，China)

Ob jective:To analyze the physiological and biochem ical characteristics and nitrate p roducing capability of Kluyvera ascorbata isolated from ginger.To exp lore reasons and rules for nitrite p roduc tion in ginger.Methods: Biochem ical characteristics were tested.The grow th of Kluyvera ascorbata was observed in different tem perature，concentration of sodium chloride and pH.Nitrite concentration change in gingerwere determ inated after gingerwas contam inated by Kluyvera ascorbata.Result:The nitrate reducing test of Kluyvera ascorbata was positive.Kluyvera ascorbata d ied g radually at 1℃，4℃and pH4.0.However，it could grow slow ly at 8℃，1%sodium chloride，2% sod ium chloride，pH5.0 and pH6.0 in culture m ed ium.Nitrite concentration was at peak when the number of Kluyvera ascorbata was 108CFU/g in most of ginger.Conclusion:Kluyvera ascorbata had nitrate reduc tion capacity.Kluyvera ascorbata couldn’t g row below 4℃.The ideal g row th conditions were at 1%～2%sodium chloride and pH5.0～6.0.Mass p ropagation of Kluyvera ascorbata could lead to generate high nitrite concentration in ginger.

Kluyvera ascorbata;physiological and b iochem ical charac teristics;nitrite

TS201.6

A

1002－0306(2012)19－0063－05

2012－03－16 *通讯联系人

赖晓芳(1964－)，女，硕士，高级工程师，主要从事化学检测与管理工作。