半制备液相-高效液相色谱技术测定红松树皮中多酚物质的研究

王吉昌，王振宇，2，* ，文 攀，樊梓鸾

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;

2.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040;3.琼州学院，海南五指山 572200）

半制备液相-高效液相色谱技术测定红松树皮中多酚物质的研究

王吉昌1，王振宇1，2，*，文 攀3，樊梓鸾1

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;

2.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040;3.琼州学院，海南五指山 572200）

采用超声波法提取红松树皮多酚，对大孔树脂AB－8进行纯化，半制备液相色谱技术进行二级纯化，最后利用高效液相色谱技术对纯化的红松树皮多酚成分进行分析。鉴定出六种多酚化合物，主要为酚酸类和黄酮类化合物，分别为水杨酸、咖啡酸、香草酸、香豆酸、儿茶素和黄芩苷，多酚含量分别为（117.7±3.1）、（54.2±3.2）、（101.3±2.8）、（321.4±1.0）、（25.3±1.9）、（8.05±1.2）mg/100g，相关系数R2均大于0.99。前期研究表明，红松树皮多酚可以有效地清除自由基，具有抗癌、抗辐射、抗疲劳等抗氧化生物活性，主要和其中的多酚组成有密切关系，为红松多酚进一步研究提供科学依据。

红松树皮，多酚化合物，半制备液相，高效液相色谱，天然产物

近年来药食同源的植物资源受到了广泛的重视，开发自然界中具有生物活性的植物提取成分应用于保健食品和功能性植物制剂的研制具有巨大潜力及应用价值，药用植物的开发及应用在人类疾病的预防和治疗中占有极其重要的地位。天然传统药物是创新药物研究开发的重要源泉，与人工合成药物相比具有排异作用小、药效平稳持久、适用人群广泛等优点［1］。红松亦称果松、海松。常绿乔木，高达40m。叶五针一束，长6～12cm，松树皮丰富。红松是我国东北地区重要的松属树种，分布于我国东北长白山到小兴安岭地区，常与鱼鳞松、红皮云杉等组成混交林。研究表明，松树植物中含有多酚类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等多种生物活性，是天然的抗氧化剂［2－3］。而红松树皮中含有大量的多酚类化合物，为了寻找红松树皮的活性成分，本文在国内外首次对小兴安岭红松树皮多酚组分进行了鉴定。通过本课题组对红松树皮多酚的药理活性和成分分析的研究［4］，为红松树皮的综合利用、变废为宝提供科学依据。通过寻找其中的有效成分和活性先导化合物，为新药的研究与开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

儿茶素、黄芩苷芦丁、肉桂酸、原花青素、异槲皮苷标准品 色谱纯;甲醇、三氟乙酸、乙腈 色谱纯，Sigma公司;无水乙醇;实验用水 经Milli－Q净化系统（0.22μm过滤膜）过滤的去离子水;其它试剂 均为分析纯;水杨酸，咖啡酸，香草酸，香豆酸。

1100型高效液相色谱仪 配备G1311A型四元梯度泵，G1313A型100位自动进样器，G13162A型示差折光检测器，G1316A型柱温箱，Agilent Zorbax carbo－hydrate柱（4.6mm ×250mm，5μm），Agilent公司;LC3000型半制备液相色谱仪 柱填料（Daisogel C18－10u 100A），P3000 高压输液泵，UV3000 可变波长检测器，层析柱（φ50cm×500cm），北京创新通恒科技有限公司;大孔树脂AB－8 南开大学化工厂;KQ－5200超声波清洗器，高速万能粉碎机，Sp－752PC型紫外可见分光光度计，R205型旋转蒸发器，TGL－16G高速离心机。

1.2 红松树皮多酚提取及纯化

1.2.1 红松树皮多酚样品提取 取50g红松树皮，用万能捣碎机粉碎，过30目筛置于2000mL烧杯中，按料液比1∶30（g/mL）加入45%乙醇，置于超声波破碎仪中，在50℃，超声功率160W条件下提取30min，以4000r/min转速离心10min，将残渣连续提取3次，合并提取液。采用真空刮板式薄膜浓缩，得到红松树皮多酚浓缩液［5］。

1.2.2 红松树皮多酚纯化 用AB－8型大孔树脂富集红松树皮多酚，乙醇进行梯度洗脱。再用真空刮板式薄膜浓缩设备浓缩，最后使用真空冷冻干燥机真空冻干，获得红松树皮多酚冻干粉末，放置于4℃冰箱中备用。

用半制备液相色谱进行二级纯化，采用Daisogel C18－10u 100A 分析柱，柱温（25℃）下流量10mL/min，在紫外线探测器波长280nm下进行测定。对提取物分别采用三个非线性浓度梯度的混合溶剂洗涤，溶剂A:在水中混入0.02%三氟乙酸（TFA），溶剂B:在甲醇中混入0.02%TFA。溶剂梯度体积比例如下0～10min，95A/5B;10～30min，50A/50B;30～50min，30A/70B;50～60min，95A/5B。两次进样的平衡时间为10min，重复进样5次，根据出峰变化及时收集各段多酚组分，然后用旋转蒸发仪浓缩至10mg/mL［7］。

1.3 红松树皮多酚含量的测定

用 Folin－Ciocalteu 方法［6］测定提取物的总多酚含量。取0.25mL样品置于25mL容量瓶中，容量瓶内预先放入6mL水，加入1.25mL Folin－Ciocalteu试剂，1min后加入20%的碳酸钠水溶液，最后用水定容至25mL。对照组不加提取液，其余试剂相同。25℃下水浴2h，测760nm的吸光值，与没食子酸的标准曲线对比，计算样品多酚含量，数据处理为均值±标准偏差（n=3）。

1.4 标准品溶液的配制

分别准确称取5mg水杨酸、咖啡酸、香草酸、香豆酸、儿茶素、黄芩苷、芦丁、肉桂酸、原花青素和异槲皮苷，用甲醇分别定容至5mL，得每个标准品的标准溶液。分别移取1.00mL各单个标准品，混合定容至25mL得混合标准贮备液。使用时分别准确移取各标准贮备液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，用甲醇定容至10mL。标准溶液不使用时置于4℃冰箱中保存。

1.5 高效液相色谱分析条件

将红松树皮多酚化合物置于250mm×4.6mm，颗粒尺寸 5μm，Zorbax carbo－hydrate分析柱，室温（22℃）下流量0.7mL/min，在紫外线探测器波长280nm下测定。流动相条件同1.2.2，在两次注入之间可以有10min的平衡时间，所有的提取物和标样都分别溶于浓度为10mg/mL和0.5mg/mL的甲醇溶液，标样和样品溶液都分为三份［7］。

2 结果与讨论

2.1 AB－8大孔树脂富集红松树皮多酚结果

用AB－8型大孔树脂，上样浓度1.5mg/mL，上样流速2.0BV/h，pH 3.0，乙醇为洗脱剂，并采用20%、40%和60%乙醇进行梯度洗脱。洗脱流速1.5BV/h，洗脱程序为:20%乙醇洗脱2.0BV，40%乙醇洗脱2.0BV，60%乙醇洗脱1.0BV，每5min接一个管。采用福林酚法测定各管中多酚物质含量，根据洗脱液各管中的多酚物质含量，绘制洗脱曲线如图1所示。

图1 AB－8大孔树脂洗脱曲线图Fig.1 Macroporous resin of AB－8 elution curve

由图1可以看出，40%乙醇洗脱液对AB－8大孔树脂的洗脱效果最明显，最高达到62.18μg/mL。合并40%乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥获得红松树皮多酚粉末1.85g，置于4℃冰箱中备用。

2.2 半制备液相色谱纯化红松树皮多酚结果

用半制备液相色谱进行二级纯化，取0.1g冻干粉末置于10mL的甲醇溶液中，用0.45μm有机膜过滤，上样量2mL，根据出峰时间分别准确地收集洗脱液如图2所示，反复进样5次，合并洗脱液，然后减压浓缩至10mg/mL，置于4℃冰箱中备用。

2.3 标准样品的测定

2.3.1 标准样品色谱图 选用松属植物树皮中常见的水杨酸、咖啡酸、香草酸、香豆酸、儿茶素、黄芩苷、芦丁、肉桂酸、原花青素和异槲皮苷等标准品，根据1.5的色谱条件进样，经过和红松树皮多酚样品的比较，鉴定出其中六种多酚的出峰时间和红松树皮多酚样品一致，分别为1:水杨酸（salicylic acid），2:咖啡酸（caffeic acid），3:香草酸（vanillic acid），4:香豆酸（coumaric acid），5:儿茶素（catechin），6:黄芩苷（baicalin）。多酚的标准样品色谱图如图3所示。

表1 回归方程和相关系数及检测限Table 1 Regression equation，coefficient and detection limit

图2 半制备液相色谱图Fig.2 Semi－preparative liquid chromatography

图3 多酚标准样品的高效液相色谱图Fig.3 Chromatogram of polyphenols koraiensis standard sample

2.3.2 标准曲线和检测限的测定 根据1.5的色谱条件，分别将不同浓度的多酚标准溶液进样分析，根据峰面积与标准物质的含量关系进行线性回归，同时测得最低检出限，结果见表1。五种目标成分都在线性范围内，相关系数R2均大于0.99，表明线性关系良好，能满足定量分析的要求。

2.4 红松树皮样品的测定

2.4.1 红松树皮样品中多酚物质的定性分析 在同样的分析条件下，根据1.5的色谱条件进样，将红松树皮多酚成分与标准品的保留时间进行对比，以及内部PDA紫外光谱进行鉴定。红松树皮样品的色谱图4与标准品色谱图3比较，鉴定其含有六种多酚化合物，分别为儿茶素（39.726min）、香草酸（44.092min）、咖啡酸（46.172min）、香 豆 酸 （55.053min）、水 杨 酸（58.503min）和黄芩苷（85.332min）。

2.4.2 红松树皮样品中多酚物质的定量分析 样品中各酚类物质的含量以峰面积查相应的标准曲线求得，结果见表2。含量最丰富的是香豆酸（321.4±1.0）mg/100g、水杨酸（117.7±3.1）mg/100g和香草酸（101.3±2.8）mg/100g，其次是咖啡酸（54.2±3.2）mg/100g和儿茶素（25.3±1.9）mg/100g，含量最少的成分是黄芩苷（8.05±1.2）mg/100g。

图4 红松树皮样品的高效液相色谱图Fig.4 Chromatogram of polyphenols of Pinus koraiensis bark

表2 红松树皮中多酚物质的含量（mg/100g）Table 2 The contents of polyphenol in Pinus koraiensis bark（mg/100g）

3 结论

本实验利用半制备液相色谱－高效液相色谱技术研究红松树皮多酚化合物，在国内外首次鉴定出六种多酚化合物，主要为酚酸类和黄酮类化合物，分别为水杨酸、咖啡酸、香草酸、香豆酸、儿茶素和黄芩苷，多酚含量分别为（117.7±3.1）、（54.2±3.2）、（101.3±2.8）、（321.4 ±1.0）、（25.3 ±1.9）、（8.05 ±1.2）mg/100g。本课题组前期研究表明，红松树皮多酚具有多种药理活性成分，可以有效地清除自由基，具有抗癌、抗辐射、抗疲劳等多种抗氧化的生物活性，是一种具有较好前景的天然药用资源。本实验能为红松多酚进一步研究提供科学有效的理论依据。

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Study on the polyphenols of Pinus koraiensis bark determined by semi－preparative liquid—high performance liquid chromatography

WANG Ji－chang1，WANG Zhen－yu1，2，*，WEN Pan3，FAN Zi－luan1
（1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China;2.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;3.Qiongzhou University，Wuzhishan 572200，China）

The polyphenols of PKB was extracted by response surface optimizing ultrasonic method.Secondary，it was purified by macroporous resin AB－8 and semi－preparative liquid chromatography.And finally，the polyphenols component of PKB were analyzed by high performance liquid chromatography.There were more than six phenolic compounds identified in PKB，mainly phenolic acids and flavonoids，which were salicylic acid，caffeic acid，vanillic acid，coumaric acid，catechin and baicalin.Polyphenol content were（117.7 ±3.1），（54.2 ±3.2），（101.3 ±2.8），（321.4±1.0），（25.3 ±1.9），（8.05 ±1.2）mg/100g respectively，correlation coefficient R2were more than 0.99.It had been showed that the polyphenol in PKB could eliminate free radicals effectively，owning anti－cancer，anti－radiation，anti－fatigue，anti－ oxidation of biological activity，which were mainly related to the composition of polyphenols in PKB，that would provide the scientific basis for further research of red pine polyphenols.

red pine bark;polyphenol compounds;semi－preparative liquid;HPLC;natural products

TS207.3

A

1002－0306（2012）02－0073－04

2011－01－04 *通讯联系人

王吉昌（1985－），男，硕士研究生，研究方向:天然产物分离纯化。