火龙果茎段组织培养快繁技术研究

2012-10-22王云山周美虹康黎芳曹冬梅段九菊

山西农业科学 2012年5期

王云山，周美虹，康黎芳，曹冬梅，张超，段九菊

（1.山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031；2.太原市迎泽李园农业科技培育场，山西太原030045）

火龙果（Hylocereus undatus）又称红龙果、仙蜜果，属仙人掌科三角柱属，原产于墨西哥等中美洲地区，是一种具有较高经济价值和保健美容作用的新兴水果[1]。火龙果植株为多年生肉质植物，花蕾似漏斗，一般于傍晚开花，凌晨逐渐凋萎。自花授粉，但坐果率低，因此，一般采用人工授粉。不同品种的火龙果果肉颜色不同，有白色、红色、黄色、紫红色等，而且营养价值极高，含有丰富的维生素、纤维素、葡萄糖及人体所需K，Ca，Mg等多种矿物质、蛋白质，但脂肪含量较少[2-3]。另外，火龙果耐旱、耐瘠薄，抗性强，能够在旱坡地种植，具有保持水土、减少沙化、改善生态环境的作用[4-5]。因此，其在生产上具有较大的发展前途及经济价值。

目前，火龙果的繁殖主要通过种子、扦插、嫁接等方式，这些方法的繁殖速度较慢，又受繁殖材料供应的限制，很难满足市场的需求。近年来，科研工作者一直尝试用组织培养的方式繁殖火龙果[6-14]，且已取得了一定的成效。本研究在前人研究的基础上，探索用火龙果幼嫩茎段作为外植体进行组织培养，以达到快速繁殖的目的，从而实现火龙果的工厂化生产。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验以火龙果幼嫩茎段作为外植体，供试材料于2010年7月取自太原市迎泽李园农业科技培育场。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的取材从温室中生长健壮的火龙果母株上，剪取 2～3，5～7，15～17 cm共 3种长度的带刺座幼嫩茎段作为外植体，观察不同外植体对愈伤组织诱导以及刺座不定芽萌发的影响。

1.2.2 外植体的灭菌剪取生长健壮的母茎上的新生茎段，在洗衣粉液中用软毛刷刷洗并用流水冲洗干净，然后置于超净工作台内用镊子小心剥去刺座上的小刺和毛，之后用75%的酒精快速消毒30 s，然后将茎段置于0.1%的升汞溶液中浸泡消毒。其中，流水冲洗时间设0.5，1 h 2个处理，0.1%的升汞溶液消毒时间设7，10，15 min共3个处理，组成6个组合。表面消毒完成后用无菌水冲洗4次，每次5 min左右。消毒过程中要搅拌外植体，使其充分接触消毒液，提高消毒效果。将消毒后的茎段横切成1.5 cm左右长的茎段，基部向下接种到诱导培养基上。培养1周后，统计其污染率和褐死率。

1.2.3 外植体诱导培养基筛选沿波浪形棱缘纵向切成长×宽为1.5 cm×1.5 cm、带有刺座的小块（去除髓部及药剂接触过的伤口），每块上均留有1个刺座，垂直接种在培养基上。培养基以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA和NAA，蔗糖30 g/L，琼脂5 g/L，pH值为5.8。6-BA质量浓度分别为 2，4，5，8，10 mg/L，共 5 个水平；NAA分别为 0.05，0.1，0.2 mg/L共 3个水平，共计15个处理。

每个处理10瓶，每瓶2块，培养45 d，统计其刺座不定芽的诱导率。培养室温度为（25±3）℃，每天光照 12 h，光照强度 1 500～2 000 lx。

1.2.4 分化增殖培养基筛选将诱导出的不定芽切成3～5个芽作为一丛（大小、长势要一致），接种于分化增殖培养基上，进行不定芽分化增殖。基本培养基为MS，琼脂为5 g/L，蔗糖30 g/L，激素 6-BA 质量浓度为 1.0，3.0，5.0，8.0 mg/L，共4个水平；激素NAA质量浓度为0.05，0.1，0.2 mg/L，共3个水平。合计12个处理。

每个处理5瓶，每瓶3块，培养30 d，统计其刺座不定芽的增殖率。

1.2.5 生根培养基筛选取同一增殖培养基中生长健壮、高达2 cm以上的小苗接种到生根培养基中，生长30 d后统计其生根情况。基本培养基为：大量元素减半的1/2 MS，琼脂5 g/L，蔗糖30 g/L。IBA质量浓度分别为 0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mg/L，共7个水平；NAA质量浓度分别为0.5，2.0 mg/L，共2个水平。为了研究活性炭对生根褐化的影响，另加1个IBA 1.0 mg/L＋活性炭2 g/L的处理，共10个处理。

每个处理5瓶，每瓶3～6块。生长30 d观察其生根情况。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌方法对火龙果外植体的影响

从表1可以看出，以火龙果母茎上的新生茎段为材料，用0.1%的升汞消毒15 min的污染率最低，但消毒15 min的材料大部分刺座及茎棱组织有褐化并逐渐坏死的现象，说明15 min的消毒时间过长，茎段的组织细胞被杀死。这与周传明等[15]报道的火龙果外植体在不同消毒时间过程中的现象是一致的。综合考虑，材料灭菌以流水冲洗0.5 h＋75%酒精消毒30 s＋0.1%的升汞消毒10 min处理最佳。

表1 不同灭菌方法对火龙果外植体的影响

2.2 不同外植体对愈伤组织诱导及刺座不定芽萌发的影响

从表2可以看出，不同长度的带刺座棱片均能产生愈伤组织，刺座上的不定芽大部分可以启动生长，但有差异，其中，以2～3 cm长的幼嫩茎段诱导效果最佳。外植体接种1周后，切口变厚，切口处产生疏松的淡绿色愈伤组织，20 d后切口表面突起呈半球状，形成绿色愈伤组织。刺座则在10～14 d后长出带有白色茸毛的小突起，20～30 d后不定芽萌出，形成一个类似鹿角状的组织。

表2 不同外植体对愈伤组织诱导及刺座不定芽萌发的影响

2.3 不同培养基对火龙果外植体刺座不定芽诱导分化的影响

本研究采用的诱导火龙果刺座不定芽分化的激素组合为6-BA和NAA，其不同质量浓度组合对不定芽诱导分化的影响如表3所示。

从表3可以看出，火龙果在MS附加不同质量浓度的 6-BA（2～10 mg/L）和 NAA（0.05～0.2 mg/L）的培养基上均能诱导刺座产生不定芽。在本试验条件下，当较高质量浓度的6-BA（4～8 mg/L）与适宜质量浓度NAA组合（处理4～8，10，11）时，外植体刺座不定芽诱导率较高，达50%～75%；当较低质量浓度的6-BA（2 mg/L）与 NAA（0.05～0.2 mg/L）组合（处理 1，2，3）时，刺座不定芽分化率较低，仅为5%～25%。当NAA质量浓度相同、6-BA质量浓度降低，或6-BA质量浓度相同、NAA质量浓度提高时，大部分表现为不定芽分化率下降。综上所述，不同的激素质量浓度组合对火龙果刺座不定芽的诱导效果不同，以4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA组合时效果最好，其刺座不定芽分化率最高，可达到75%。

表3 不同培养基对火龙果刺座芽诱导分化的影响

2.4 不同培养基对芽增殖与生长的影响

由表4可知，当6-BA质量浓度为8 mg/L，NAA质量浓度为0.05 mg/L（处理10）时，不定芽的繁殖系数最高，达6.0，但其不定芽生长缓慢，呈细弱状，且褐化现象严重。当6-BA质量浓度为1 mg/L，NAA质量浓度为0.2 mg/L时，虽然不定芽的繁殖系数低，但其不定芽生长较快、苗壮。在NAA质量浓度相同时，随6-BA质量浓度的增加，芽的繁殖系数随之增加，同时不定芽生长减缓，长势减弱且褐化严重。当6-BA质量浓度相同，NAA质量浓度提高时，不定芽繁殖系数则下降，气生根增多。

在继代过程中，可以根据生产的需要先在6-BA 8 mg/L＋NAA 0.05 mg/L培养基中培养7～10 d，待刺座上长出许多小突起，再转接于6-BA 1 mg/L＋NAA 0.2 mg/L培养基中进行生长培养。这样交替培养，可以调节不定芽的增殖与生长，从而达到既有较快的繁殖速度，又能保证有较好的小苗且减少褐化苗的目的。

表4 不同培养基对芽增殖与生长的影响

2.5 不同培养基对火龙果生根的影响

从表5不同培养基对火龙果生根的影响可以看出，IBA在0～3 mg/L范围内，生根率和生根数随着浓度的升高而提高，尤其以1/2 MS＋IBA 2.0 mg/L处理的生根效果最好，生根率为86.96%，平均每株生根数5条。培养7～10 d开始有气生根生出。当IBA质量浓度达4.0 mg/L时，对根的形成起抑制作用。结果还表明，IBA的生根效果比NAA好。添加活性炭（处理4）虽可减轻根的褐化，但与处理3相比，抑制了生根，因此，活性炭对生根没有益处。

表5 不同培养基对火龙果生根的影响

3 结论与讨论

外植体表面灭菌的关键是选择合适的消毒剂和消毒时间，而消毒剂中，以升汞的杀菌能力最强、最常用，但它对外植体的伤害也最大，不易去除。消毒时间太长，外植体吸入升汞量较多，轻者会对外植体产生毒害，抑制细胞分裂和新陈代谢，使芽苗生长减弱，重者会使外植体中毒死亡。本试验结果表明，火龙果幼嫩茎段的灭菌以流水冲洗0.5 h＋75%酒精30 s＋0.1%升汞10 min处理最佳。污染多数在芽眼的丛刺处出现，这是由火龙果茎段芽眼处有成丛的叶刺，外植体不易清洗干净，消毒剂也较难透入，灭菌不彻底造成的。

在组织培养过程中，芽苗的发育受到细胞分裂素与生长素比例高低的调控，细胞分裂素能诱导不定芽形成，削弱顶端优势，促进侧芽的萌发；而生长素能促进细胞伸长，加强顶端优势。当细胞分裂素与生长素浓度比例适当时，二者能互相协同作用，有利于不定芽的形成。

本试验结果表明，不定芽诱导培养基以MS＋6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L最佳。当6-BA质量浓度为8 mg/L和NAA质量浓度为0.05 mg/L时，不定芽的繁殖系数最高；当6-BA质量浓度为1 mg/L和NAA质量浓度为0.2 mg/L时，不定芽生长较快、苗壮，因此，可以根据生产的需要交替使用这2种培养基。适宜的生根培养基为1/2 MS＋IBA2.0 mg/L。

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