阿维A治疗寻常性银屑病疗效与药物遗传学相关性研究

谢韶琼，陈 敏，万庆华，宋 勋，汪青良，张玲琳

银屑病因其发病率高，发病原因不明，长期治疗效果不理想，给患者身心健康带来极大的痛苦[1]。临床实践发现，具有同一种疾病的不同患者对同一药物的疗效不一样，而药物效应的个体化差异常常导致经验用药的失败，甚至出现严重的不良反应。阿维A是临床上治疗寻常性银屑病的首选药物[2,3]，但是，笔者在长期的临床实践中发现，同是寻常性银屑病患者，采用同样剂量的阿维A系统治疗，临床疗效和患者的不良反应差异很大。国外已有学者对血管表皮生长因子（VEGF）与药物遗传学相关性进行了研究[4]。本研究拟采用药物遗传学研究方法，通过对患者基因单核苷酸多态性[VEGF-460(rs833061)，VEGF+405C(rs2010963)]的检测分析，结合阿维A治疗寻常性银屑病的疗效观察，研究我国寻常性银屑病患者系统用药效应基因多态性的特点，探讨其与银屑病病情及系统药物治疗的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择 选取2010年3月～2011年9月在上海市皮肤病医院住院的寻常性斑块状银屑病患者105例。①诊断标准：参照2002年国家药品监督管理局组织制定的《中药新药临床研究指导原则》[5]中寻常性银屑病的西医诊断标准。皮肤损害以红色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片为主，上覆多层银白色鳞屑，刮去鳞屑可见一层光亮的薄膜，薄膜下可见点状出血（Auspitz征）。②入选标准：符合寻常性银屑病诊断标准，选择斑块状银屑病患者，年龄16～80岁；不符合排除标准任意一项；治疗前3个月内未使用过维A酸、免疫抑制剂，未接受过光疗、药浴等治疗；入选患者治疗前银屑病皮损面积严重度指数（PASI）评分10～12分；自愿参加本研究，能配合按期随访并签署知情同意书者。③排除标准：并发严重的心、肝、肺、肾等内脏疾病及高血脂患者；妊娠期、哺乳期妇女；对本试验药物过敏者；治疗期间随意中止或更换治疗药物及方法者；关节性、脓疱性、红皮病性银屑病患者。

入选的105例患者中男79例，女26例，平均年龄（38.7±13. 9)岁，平均病程（6.5±3. 3)年。抽取每例患者的外周血4 ml备用。

1.1.2 主要仪器与试剂 PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪（美国 ABI 公司）；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司）；移液器（范围：100～1 000 ml，20～200 ml，0.5～ 10 ml）（加拿大 BBI公司）。TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(不含 Mg2+，其主要成分：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500 mmol/L KCl，0.8%（v/v）Nonidet）；MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程有限公司）；PCR产物纯化回收试剂盒（生工生物工程有限公司，编号SK1141）；10×TAE（电泳缓冲液，成分：400 mmol/L Tris-acetate，10 mmol/L EDTA，pH8.0）。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 不同基因型引物设计及PCR扩增：用上述酶和试剂抽提外周血DNA，-20 ℃保存备用。每例选用备选基因VEGF的2个位点（VEGF+405和VEGF-460），引物序列查自http://www.ncbi.nih.gov/unists，由上海生物工程有限公司合成，用应用软件Primer Premier 5（表1）。50 ml反应体系中，第1轮模板1 ml，引物F 1 ml，引物R 1 ml，dNTP 10 mmol/L 1 ml，Taq Buffer 5 ml，25 mmol/L MgCl25 ml，Taq 酶0.5 ml，水35.5 ml；第2轮模板（第1轮PCR产物）0.2 ml，灭菌水36.3 ml，余同第1轮。PCR反应条件：预变性95 ℃，3 min；变性94 ℃，30 s ；退火58 ℃，30 s ；延伸72 ℃，45 s；修复延伸，5 min；循环25次。

表1 不同基因型引物序列

1.2.2 电泳 1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA、20 min电泳观察。

图1 基因rs833061序列图

图2 基因rs2010963序列图

1.2.3 测序 PCR产物纯化回收试剂盒（生工生物工程有限公司SK1141），F引物测序。检测结果见图1，图2。

1.2.4 治疗方法 给予每例患者阿维A 20～30 mg/d[0.4 mg/(kg·d)]，3个月后总结疗效，治疗前以及治疗过程中每个月检查肝、肾功能，血脂，血常规各1次。

1.2.5 疗效评判 根据张长宋等[6]的方法改良。治疗前、后分别对患者进行PASI评分，疗效指数=（治疗前PASI评分－治疗后PASI评分）/ 治疗前PASI评分×100%。痊愈：皮损全部消退，PAS1分值下降90%。显效：皮损明显消退，PAS1分值下降80%。有效：皮损部分消退，PAS1分值下降50%。无效：皮损消退不明显，PAS1分值下降不足50%。

1.3 统计学方法

采用SPSS10.0软件，率的比较采用卡方检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 1%琼脂糖电泳结果

基因rs833061和rs2010963扩增条带的大小分别为271 bp和172 bp（图3，4）。

图3 扩增的rs833061条带片段电泳图，大小为271 bp

图4 扩增的rs2010963条带片段电泳图，大小为172 bp

2.2 寻常性银屑病患者VEGF基因型分布情况

105例寻常性银屑病患者中，1例因丙氨酸转氨酶偏高、1例因血脂过高、3例因皮肤黏膜干燥而退出本研究。每例选测2个位点（基因rs833061和基因rs2010963），其中基因rs833061C/C型10例（10%），rs833061T/T型 46例（46%），rs833061C/T型44例（44%）；基因rs2010963G/G型51例（51%），rs2010963C/G型33例（33%）, rs2010963C/C型16例（16%）（图5）。

图5 100例寻常性银屑病患者VEGF基因型分布比例

2.3 阿维A治疗不同基因型寻常性银屑病患者的疗效

治疗前对不同基因型组的寻常性银屑病患者进行PASI评分，经t检验各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 基因rs833061C/T型寻常性银屑病患者口服阿维A的有效率为 90.9%, rs833061C/C型患者有效率为70.0%，rs833061T/T型患者有效率为63.0%，基因rs833061C/T型患者的有效率与其他各型相比差异有统计学意义（P＜0.05）。基因rs2010963G/G型寻常性银屑病患者口服阿维A有效率为70.6%,rs2010963C/G型患者有效率为69.7%, rs2010963C/C型患者有效率为68.7%，除rs833061C/T型外，其余各型之间的有效率相比差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 阿维A治疗不同基因型寻常性银屑病患者的疗效对比 （例）

3 讨论

阿维A是美国FDA批准治疗银屑病3种一线药物（甲氨蝶呤、阿维A、环孢素）中最安全的一种，是目前治疗银屑病的首选药物。药物遗传学研究证明，药物效应基因多态性是确定不同患者产生不同疗效和不良反应的基础。近年来，人类基因组计划的完成为该现象做出了解释：人类基因存在着大量的单核苷酸多态位点，这是造成不同个体在相同环境中对疾病的易感性、对药物的敏感性及不良反应不同的原因[7,8]。此前，研究较多的是某些基因与银屑病发病及病情的相关性，或者阿维A对银屑病患者VEGF的影响[9,10]。国外有研究证明，阿维A治疗寻常性银屑病的临床疗效与患者VEGF不同基因型有很大的相关性，确定VEGF多态性和每例患者VEGF的标志可以作为预测银屑病治疗反应的手段[4]，但是目前没有系统的临床和实验研究。据此，本研究旨在通过对我国寻常性斑块状银屑病患者血液VEGF多态性检测，结合阿维A的疗效，分析两者的相关性，为今后临床选药、提高疗效、减少药物不良反应提供借鉴，为进一步的基因和药物疗效相关性研究奠定基础。

随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，人们可以利用先进的分子生物学技术对不同个体的药物相关基因进行解读，临床医师可以根据患者的基因型资料实施给药方案，并“量体裁衣”式地合理用药，以提高疗效和降低不良反应，同时减轻患者的病痛和经济负担。这种基因导向的个体化用药，代表着药物基因组学与临床遗传学的完美结合，具有划时代的意义。

本研究结果显示，100例寻常性斑块状银屑病患者有不同的VEGF基因型，采用阿维A 0.4 mg/(kg·d)治疗3个月后，基因rs833061C/T型患者的治疗效果最好。希望今后通过类似的更大样本研究得出科学结论，通过快速单核苷酸多肽检测，为阿维A治疗寻常性银屑病提供选择性借鉴，提高其临床疗效，减少不良反应。

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