单胚胎RT-qPCR对猪体细胞核移植囊胚全能性的分析

吉林大学畜牧兽医学院 谢万华 陈仙菊 姚朝刚 韩 阳 逄大欣 唐晓春

体细胞核移植技术现已成功应用到牛、小鼠、猪、兔和狗等多种哺乳动物，其在生物医学和生命科学研究等领域具有较大价值。然而，体细胞核移植技术存在克隆效率低下，大量的克隆动物出生后就死亡，或者各种器官发育不正常等问题。有研究认为，克隆动物发育不正常主要是供体细胞核重编程不完全导致的 （Hochedlinger和Jaenisch，2003）。处于分化状态的供体细胞核需要通过卵母细胞中一些重编程因子的作用将其转化为胚胎的去分化状态才能继续发育。目前关于重编程的机制了解甚少。研究发现，重编程因子是通过调控一些关键基因的表达从而维持正常的发育（Tamashiro等，2002）。因此，通过对胚胎发育中关键基因的研究，可以揭示发育的机制。然而，胚胎间的发育是相对独立的过程，即使在同一母体内，受精卵的发育也不是同步进行的，各个胚胎中基因的表达存在很大差异。而传统的基因表达研究方法需要从大量的样品中获取模板，极大的限制了其对微量样品的研究，如胚胎的发育。因此，有必要从单胚胎水平来研究胚胎的发育（Stahlberg等，2011；Wang 和 Bodovitz，2010）。 本试验从单胚胎水平，分析了猪体细胞核移植囊胚和体内囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和 Sox2）的表达量，同时还比较了这两种囊胚的质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪卵巢和动物 猪卵巢采自长春市绿园区屠宰场。试验动物为怀孕33～35 d的长白母猪和人工授精5 d的长白母猪，均来自吉林大学种猪场。

1.1.2 主要试剂 Nonidet P-40购于Amresco公司；SUPERase-In RNA酶抑制剂购于Applied Biosystems公司；SuperScriptⅢ 反转录酶、5×First-Strand Buffer、DTT均购于 Invitrogen公司；RiboLock RNA酶抑制剂、去RNA酶水均购于Fermentas公司；T4噬菌体基因32编码蛋白购于New England Biolabs公司；SYBR GreenⅠ荧光PCR试剂盒购于杭州博日科技有限公司。

1.1.3 主要器材 体视显微镜、显微操作仪、倒置荧光显微镜购于日本Nikon公司；超净工作台、4℃恒温离心机、CO2培养箱购于美国Thermo公司；BTX 2000电细胞融合仪购于美国BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的采集与体外成熟 从屠宰场采集猪卵巢，放于有青霉素和链霉素的生理盐水中，以35℃恒温运回实验室。用12号无菌注射器抽取直径为3～6 mm卵泡中的卵母细胞。在体视显微镜下迅速挑取包含有3层以上卵丘细胞、致密、胞质均匀的卵母细胞，用TL-HEPES-PVA液洗涤3次，再用猪卵母细胞体外成熟培养液洗涤3次后放于成熟液中，于38.5℃，5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养（Lai和 Prather，2003）。

1.2.2 供体细胞的制备 通过手术获取怀孕33～35 d的长白猪胎儿，用剪刀、镊子去胎儿头、尾、四肢和内脏，其余部分用剪刀剪碎，然后用胶原蛋白酶消化组织。用含20%FBS的DMEM培养液原代培养。0.25%胰蛋白酶消化成单细胞后，用含10%FBS的DMEM传代培养。核移植使用前，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞悬液。

1.2.3 重构胚的构建 将体外成熟42～44 h的卵母细胞用透明质酸酶处理，去除颗粒细胞。在体式显微镜下挑取排除第一极体的成熟卵母细胞，用操作液洗涤 3次（Lai和 Prather，2003）。 核移植在含7.5 μg/mL细胞松弛素B的操作液中进行。将卵母细胞第一极体调到5点钟方向，用内径为20 μm的注射针从卵母细胞3点钟方向刺入，吸出第一极体及其附近的胞质，从而去核；吸取一个成纤维细胞从原来的口将其注入透明带与卵母细胞膜间的卵周隙中。

1.2.4 重构胚的融合与激活 重构胚的融合和激活在BTX 2000电细胞融合仪作用下完成。将重构胚胎放于盛有融合液的电极槽的两电极之间（Lai和 Prather，2003）。 然后进行 1.2 kV/cm，30 μs，2次直流电脉冲使供体细胞与卵母细胞融合，同时激活卵母细胞。激活的重构用PZM-3洗涤3次，放于PZM-3中，于38.5℃，5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养。

1.2.5 体内囊胚的获取 对发情的长白猪进行人工授精。授精后第5天，通过手术的方法，用含10%FBS的PBS从母猪子宫中冲取囊胚，并且保存于38.5℃条件下，尽快运回实验室，用PZM-3洗涤3次，保存于38.5℃，5%CO2的饱和湿度的培养箱中，备用（Lai和 Prather，2003）。

1.2.6 囊胚质量检测 高倍镜下观察体内囊胚和克隆囊胚形态学上的差异。囊胚细胞数目的检测：用4%多聚甲醛固定囊胚，然后用Hoechest 33342定位细胞核，在紫外激发下用荧光显微镜观测并记录这两种囊胚的细胞数目。

1.2.7 单囊胚cDNA的制备 参考单细胞RNASeq方法，建立单胚胎cDNA制备的方法。囊胚用台氏液去掉透明带，用口吸管将去透明带的囊胚放于含0.1 mg/mL BSA的PBS液滴中洗涤3次（Tang 等，2010、2009）。 再将囊胚转移入 22.25 μL的细胞裂解液中，细胞裂解液在使用前配制，体系为：5 μL 5× First-Strand Buffer，1.125 μL 10%Nonidet P-40，1.125 μL DTT （0.1 mol/L），0.225 μL SUPERase-In RNA 酶抑制剂，0.225 μL RiboLockTM RNA酶抑制剂，0.625 μL引物 Oligo（dT）（0.5 μmol/L），0.45 μL dNTP，13.225 μL 去RNA酶水。引物Oligo（dT）序列为：5’-ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。然后将裂解的细胞样品于70℃水浴处理90 s，立刻放于冰上冰浴，使RNA从细胞中释放出来。向样品中加入2.25 μL的反转录酶混合体系（1.65 μL SuperScripⅢ 反转录酶，0.25 μL RiboLockTM RNA酶抑制剂，0.35 μL T4噬菌体基因32编码蛋白）。50℃水浴反应30 min，70℃酶灭活处理15 min。将合成的cDNA保存于-20℃。

1.2.8 qPCR引物的设计及其扩增效率的鉴定qPCR引物采用Beacon Designer 7软件设计。引物序列分别为，β-actin上游引物：GAACCCCAAAGCCAACCGT，下游引物 ：CCTCGTAGATGGGCACCGT，退火温度为60℃，扩增产物大小为 173 bp；Oct4上游引物：AAGCAGTGACTATTCGCAAC，下游引物：CAGGGTGGTGAAGTGAGG，退火温度为60℃，扩增产物大小为136 bp；Nanog 上游引物：TCCTCTTCCTTCCTCCAT，下游引物：TCCTTCTCTGTGCTCTTC，退火温度为54℃，扩增产物大小为 108 bp；Sox2上游引物：CGCAGACCTACATGAACG， 下游引物：TCGGACTTGACCACTGAG，退火温度为60℃，扩增产物大小为103 bp。用制作标准曲线的方法检测引物的扩增效率。以制得的8 μL体内囊胚cDNA为初始模板，2倍梯度稀释制备5～6个标准品，然后用这些标准品进行实时荧光定量PCR反应。从仪器自动获取标准曲线和扩增效率。实时荧光定量 PCR 反应体系：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，8 μL cDNA，1 μL 上下游引物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。

1.2.9 实时荧光定量检测囊胚的全能性基因 分别以制备的5个体细胞核移植囊胚和5个体内囊胚的cDNA为模板，用iQ 5实时定量PCR检测系统以 SYBR Green I为荧光染料检测 Oct4、Nanog和Sox2的表达量。实时荧光定量PCR反应体 系 ：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，2 μL cDNA，1 μL 上下游引 物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。 采用相对定量方案，以2-△△Ct方法分析数据 （Livak和Schmittgen，2001）。β-actin 作为参照基因，以体内1号囊胚为参照组。用SPSS16.0软件分析数据的差异性，当P值小于0.05时认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 猪体细胞核移植囊胚质量的检测 在高倍显微镜下，对猪体细胞核移植囊胚和体内囊胚细胞形态进行比较。在Hoechest 33342染料作用下，记录了10个克隆囊胚和10个体内囊胚的细胞数目，分别为110±10.3和54±12.6。体细胞核移植囊胚中细胞总数显著降低（P<0.05）。相比体内囊胚，体细胞核移植囊胚的细胞形态差，无明显的内细胞团集落。

2.2 引物扩增效率 由图1可见，引物β-actin、Oct4、Sox2和Nanog的扩增效率 （E值）分别为99.5%、104.5%、98.3%和96.1%，PCR扩增效率为 95%～105%，相关系数（r2）>0.98，可用于实时荧光定量检测对应基因的表达。

2.3 猪体细胞核移植囊胚和体内囊胚全能性基因表达水平的比较 由图2可见，Nanog和Sox2的表达量在5个体细胞核移植囊胚中均显著低于体内囊胚；除了体内2号囊胚的Oct4表达量和4个核移植囊胚差异不显著外，其余4个体内囊胚中的Oct4表达量均显著高于5个体细胞核移植囊胚（P<0.05）。

3 讨论

本试验中，通过与体内囊胚比较，发现体细胞核移植囊胚的细胞不但形态差，而且囊胚中细胞的数目显著降低。研究表明，细胞的增殖和分化与细胞凋亡相关（Exley等，1999），并且体细胞核移植囊胚的细胞凋亡率显著高于体外受精囊胚和体内囊胚（Yu等，2007）。因此，本试验中体外培养的核移植囊胚细胞数的减少可能是由细胞凋亡导致。

为了正常的发育，在体细胞核移植中，已经分化的供体必须通过重编程的过程适当的激活某些基因和关闭某些分化基因的表达以支持胚胎的发育 （Humpherys等，2002）。在早期胚胎发育过程中，Oct4、Nanog和Sox2对维持胚胎的全能性是必须的（Bortvin 等，2003；Boiani等，2002）。 有报道证实，敲除Oct4的小鼠囊胚的内细胞团缺失全能性。Oct4与Sox2相互作用可以与Nanog基因启动子结合，从而调控Nanog的表达，三者通过网络调控细胞的全能性 （Rodda等，2005；Nichols等，1998）。本试验通过建立单胚胎RT-qPCR技术检测猪体细胞核移植囊胚和体内囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）的表达量。与体内囊胚相比，体细胞核移植囊胚中全能性基因的表达量普遍下降。分析认为，猪体细胞核移植囊胚质量差与其全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）表达量低相关。

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