一例疑似猪细小病毒感染流行的实验室诊断

陈招娣，李润成*，蒋大良，余兴龙

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起，以母猪特别是初产母猪繁殖障碍为特征的一种病毒性疾病。该病能导致母猪不孕、流产、产木乃伊胎、畸胎或死胎、新生仔猪死亡，还能导致仔猪皮炎、腹泻等。

2011年4月，湖南某规模猪场饲养的160头母猪中60头初产母猪，陆续表现流产，产死胎，木乃伊胎等。笔者对该场的母猪抽样采血并进行了猪瘟病毒抗体、蓝耳病毒抗体以及伪狂犬的野毒抗体的检测。此外还对流产死胎进行了猪细小病毒的病原学检测。现报告如下：

1 材料

1.1 病料样品

21 份母猪血液（1～10 号来自经产母猪、11～21号来自初产母猪），3头怀孕70天以内流产的死胎。

1.2 主要试剂和试剂盒

检测猪瘟病毒抗体、蓝耳病毒抗体、伪狂犬野毒抗体的ELISA 试剂盒均为美国IDEXX 公司生产，PCR 试剂购自北京全式金生物技术有限公司，琼脂糖凝胶为鼎国公司生产。

2 方法

2.1 血清抗体的检测 按试剂盒操作说明进行。

2.2 细小病毒的PCR 检测

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2.2.1 引物的设计和合成

参照GeneBank 上登陆的猪细小病毒基因序列(参考序列登陆号为EU790641)，设计一对引物，特异性扩增196bp 的DNA 片段。引物设计见表1。

2.2.2 PCR 检测

取流产死胎的肝脏、肺脏，研磨成匀浆，按蛋白酶K、酚、氯仿的方法抽提，提取基因组后，用引物Fp1 和Rpl 进行PCR 扩增猪细小病毒特异性片段，PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；进入循环，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30s，进行 35 个循环；72℃延伸7min。最后用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2.3 PCR 产物测序

将PCR 产物用纯化试剂盒进行清洁纯化，纯化后的PCR 扩增产物送北京华大生物技术有限公司进行测序并将测出的序列进行Blast 分析确定。

3 结果

3.1 血清抗体检测结果

取21 份母猪血清分别进行猪瘟病毒抗体（HCV Ab）、蓝耳病毒抗体（PRRSV Ab）、伪狂犬野毒抗体（PRV Ab）3 个项目的检测。检测结果见表2，由表2 可见21 份血清中有14 份为猪瘟抗体阳性，其中经产母猪的有7 份，初产母猪的有7 份；蓝耳病毒抗体则所有样本均为阳性，21 份样本中S/P 值均在2.0 以下；所有血清样品伪狂犬野毒抗体均为阴性。

表2 中，猪瘟抗体判定标准：阻断率≥40%为阳性（+），阻断率≤30%为阴性（-），30% ＜ 阻断率＜40%为可疑（±）；蓝耳病毒抗体判定标准：S/P值≥0.4 时为阳性（+），S/P 值 ＜0.4 时为阴性（-）；伪狂犬野毒抗体判定标准：被检样品S/N≤0.6 为抗体阳性（+）；S/N＞0.7 为抗体阴性（-）；0.6＜S/N≤0.7 为可疑（±）。

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3.2 PCR 检测结果

以提取的猪细小病毒基因组为模板，用设计的猪细小病毒特异性引物进行PCR 扩增，结果见图1，由图可见3 份病料样本均扩增出与预期大小相符的片段。

3.3 测序结果

PCR 产物纯化后送公司进行1 个反应的测序，共得到196bp 的准确序列，进行BLAST 分析发现该病毒确为猪细小病毒，序列如下：

GGACCATTAACAGCACTAAACAATACTGCACCTG TATTTCCAAATGGTCAAATATGGGATAAAGAACT TGATACAGATCTAAAACCTAGACTACATGTTACA GCTCCATTTGTTTGTAAAAACAATCCACCAGGAC AACTATTTGTAAAAATAGCACCAAACCTAACAG ATGATTTCAATGCTGACTCTCCTCAAC

4 讨论

4.1 疫情诊断

该母猪群猪瘟抗体阳性率66.67%，阴性率28.57%，可疑率4.76%；蓝耳病毒抗体阳性率为100%，且抗体水平S/P 值均在0.4～2.0 之间；伪狂犬野毒抗体均为阴性。从检测结果可见该母猪群猪瘟抗体水平不理想，但由于表现流产、产木乃伊胎的初产母猪有半数以上猪瘟抗体水平较好，抗体阻断率值在60%以上，因此可以推断该次疫情不是由猪瘟病毒引起，此外，母猪群蓝耳病毒抗体均为阳性且抗体水平比较整齐，目前该猪场应该不属于蓝耳病毒感染活跃猪群；伪狂犬野毒抗体均为阴性，表明猪群中没有伪狂犬野毒感染和流行。

取流产死胎进行猪细小病毒的PCR 检测并测序，结果表明在样本中均能检测到细小病毒基因，结合临床症状可将该场出现的初产母猪流产、产死胎、木乃伊胎确诊为细小病毒感染造成。

4.2 猪场细小病毒病的防控

猪细小病毒病是导致母猪特别是初产母猪繁殖障碍的疾病之一，随着规模化养殖的发展，母猪的健康和产仔率、仔猪成活率越来越成为养殖业的关键。笔者认为，对于猪细小病毒病的防控应做到以下几点：一是引种要规范，杜绝引进病猪和带毒猪；二是初产母猪要主动免疫后才能配种，后备公猪在配种前一个月应进行免疫接种；三是要建立规范、科学的免疫程序，定期进行血清学监测及时了解猪群免疫状况；四是应建立高标准的卫生防疫和综合防制措施，杜绝病毒的传播和污染，促进猪场健康发展。 □