藻红蛋白调控ΔΨm诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

高世勇，王 静，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076)

藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)是藻胆蛋白的一种，它广泛存在于红藻和龙须菜等植物中.根据来源藻红蛋白可以被分为C-PE，B-PE，R-PE等，由脱辅基蛋白和开链四吡咯发色团经硫醚键共价结合形成并可以发出橙红色的荧光.PE的光吸收峰位于490～570 nm之间，有的PE可产生两个吸收峰，有的PE可产生3个吸收峰[1].藻红蛋白有广泛的药理作用，其中抗肿瘤方面的作用尤为突出.藻红蛋白可以作为荧光探针应用于荧光激活细胞分选、免疫组织化学、流式细胞测定、共聚焦激光显微镜、免疫细胞化学等荧光免疫的检测[2].藻红蛋白也可以作为光敏剂通过光动力学治疗肿瘤.虽然藻红蛋白介导的光敏反应能诱导人肝癌7721细胞和S180细胞的凋亡，但是其直接抗肿瘤作用及其机制的研究却很少[3].本文以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，观察不同质量浓度的藻红蛋白对MCF-7细胞的生长抑制及凋亡作用，并检测了通过调节细胞内线粒体膜电位变化诱导MCF-7细胞凋亡的作用.探讨藻红蛋白对MCF-7细胞的凋亡作用机制.

1 实验材料

1.1 细胞株和试剂

人乳腺癌MCF-7细胞株由哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站传代保种.藻红蛋白由磐安县鸿瑞生物科技有限公司提供.RPMI1640及胰酶为Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，溴化四氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，二甲基亚砜(DMSO)为上海前尘生物科技有限公司产品，Hoechst33258染色试剂盒为碧云天生物技术有限公司产品，TMRM为美国Molecular probe公司产品.

1.2 主要仪器

CO2培养箱，美国NBS公司;酶标仪，美国Bio-Rad公司;荧光显微镜，德国Leica公司;激光共聚焦扫描显微镜，德国Leica公司.

2 实验方法

2.1 肿瘤细胞培养

乳腺癌MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞生长状态稳定，呈对数生长期时，0.25%胰酶消化细胞，加入RPMI1640培养液将消化下来的细胞吹打均匀，调整细胞至适当质量浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量，3～4 d传代1次.

2.2 MTT法测定肿瘤细胞存活率

将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰酶消化，细胞计数并调整细胞浓度为2×104个/mL的细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔板当中，放置于37℃，含5%CO2的二氧化碳培养箱中培养24 h，每孔加入100μL含不同质量浓度的PE每剂量设6个平行孔;阴性组加相同体积的培养液;阳性对照组药为阿霉素，给药后于37℃继续培养72 h后，弃去上清，每孔加入200μL新鲜配制含0.5 mg/mL MTT，继续培养4 h，弃上清液，每孔加150 μL DMSO溶解，微型振荡器振荡混匀，酶标仪测定光密度值(OD)，参考波长490 nm，检测波长570 nm.用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50.

2.3 倒置显微镜观察藻红蛋白对细胞形态学的影响

取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞，调整细胞浓度为105个/mL接种于培养瓶中，24 h后加入不同质量浓度的藻红蛋白，置37℃，5%二氧化碳培养箱中培养48 h后，置显微镜下观察细胞形态.

2.4 Hoechst33258染色荧光显微镜下观察藻红蛋白对MCF-7细胞形态学影响

取对数生长期的MCF-7细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，轻轻吹打后制备获得单细胞悬液，计数并调整细胞密度为1.5×105个/mL，接种于6孔板内，置于37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱中培养24 h后，加入不同质量浓度的藻红蛋白，使其终质量浓度分别为40、80、160μg/mL;阳性对照组加入阿霉素，药物质量终浓度为5μg/mL;阴性对照组加入相同体积的培养液，继续培养48 h后，吸出旧培养液，加入1 mLPBS洗涤1次，吸出洗液，加入1mL胰蛋白酶进行消化，吸出消化液，加入2 mL新鲜的培基终止消化，将细胞完全吹下，吸至离心管中，2 000 r/min，10 min离心，弃上清，加入多聚甲醛固定30min，除去固定液，用PBS洗涤1次，吸尽液体，加入2 mL Hoechst33258染色液，37℃避光孵育30 min，移入六孔板内，荧光显微镜下观察细胞形态，拍照.

2.5 流式细胞仪测定藻红蛋白诱导MCF-7细胞凋亡的凋亡率

人乳腺癌MCF-7细胞以每瓶106个/mL接种于培养瓶中，培养24 h后，加入不同质量浓度的藻红蛋白使其终质量浓度分别为40、80、160μg/L培养48 h，收集细胞，1 500 r/m离心5 min，PBS洗1次，70%冰乙醇-20℃固定过夜，PBS洗1次，加入PI染液(含PI 50mg/mL，RNase 1g/L，0.1%TritonX-100)，调整细胞为106个/mL，4℃避光染色30 min，300目尼龙网过滤后上机检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm，检测细胞数为104个.

2.6 激光共聚焦显微镜检测MCF-7细胞中线粒体膜电位的变化

取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞浓度为105个/mL细胞接种于6孔培养板，每孔1 mL，置培养箱内培养24 h.24 h后加入不同质量浓度的藻红蛋白，使其终质量浓度分别25、12.5、6.25 μg/L阳性对照组加阿霉素，其终质量浓度为1.5 μg/L;阴性对照组加相同体积的RPMI1640培养液;药物作用48 h后，将培养瓶中的培养液吸出至离心管内，用PBS洗1遍，加入胰酶细胞消化液消化，细胞消化后，加入收集的细胞培养液，混匀，转移至离心管内，1 500 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，加入适量的TMRE，37℃ 孵育60 min.孵育结束后，1 500 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS洗1遍，离心弃上清，用PBS重悬细胞后，激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体膜电位荧光强度(FI)，激发波长为488 nm，发射波长为540～570 nm.物镜APO CS40×/1.25oil，zoom＞1，pinhole 1.5 Airy，扫描方式(mode)为XYZ，format 512×512，结果见图1.

图1 作用48 h细胞凋亡形态

2.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理，数据统计分析进行组间t检验，结果以表示.

3 实验结果

3.1 MTT法检测藻红蛋白对MCF-7细胞的生长抑制率

MTT法检测结果显示，用不同质量浓度的藻红蛋白培养细胞72 h后，可观察到藻红蛋白对MCF-7细胞的生长具有抑制作用，IC50为质量浓度81.60μg/mL.200μg/mL的藻红蛋白在作用于MCF-7细胞72 h后，抑制率最高为89.41%，见表1.

3.2 倒置显微镜细胞形态学观察

阴性组细胞贴壁完好，轮廓清晰，没有破裂，起皱.给藻红蛋白各组随给药质量浓度增加细胞生长密度逐渐变疏，表面起皱，高质量浓度组大部分细胞破碎，细胞形态不完整，贴壁减少，见图1.

表1 藻红蛋白对MCF－7抑制作用

3.3 荧光显微镜观察藻红蛋白对MCF-7细胞形态学影响

Hoechst33258荧光染色结果显示，阴性对照组中MCF-7细胞染色质均匀，核形态规则，阳性对照组中细胞呈现致密浓染荧光.藻红蛋白给药组MCF-7细胞形态呈现出细胞凋亡现象，中剂量组可见细胞核固缩且碎裂，高剂量组可见细胞核呈现浓染，见图2.

图2 作用48 h细胞凋亡形态

3.4 流式细胞仪测定藻红蛋白诱导MCF-7细胞凋亡率

从图3及表2中可以得出，PE对MFC-7作用48 h后，凋亡率随着剂量逐渐增大，40μg/mL时调亡率为25.18%.60μg/mL时凋亡率为55.45%，160μg/mL时凋亡率达到83.94%.

图3 藻红蛋白诱导MFC－7细胞凋亡率

表2 流式细胞仪检测Phycoerythrin对MCF－7细胞的凋亡率

3.5 激光共聚焦显微镜检测MCF-7细胞中线粒体膜电位的变化

从表3中可得出，不同质量浓度PE对MCF-7作用48 h后，线粒体膜电位荧光强度分别为24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白组的膜电位为28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7细胞的线粒体膜电位，并且随着PE剂量的增加，细胞内线粒体膜电位减幅也相应地增大，且与对照组相比都具有统计学意义(P＜0.05).

表3 激光共聚焦显微镜检测ΔΨm变化

4 讨论

随着对藻红蛋白的深入研究，其药理作用也越来越多的被发现，而藻红蛋白在抗肿瘤方面的作用尤为突出.国内外大多数研究都是围绕藻红蛋白作为光敏剂或者荧光探针应用于肿瘤的治疗中，而藻红蛋白直接抗肿瘤的研究较少.近几年来，才有关于藻红蛋白粗提物直接抗肿瘤作用的报道.根据研究，藻红蛋白粗提物能提高实验小鼠机体抗突变、抗氧化和免疫能力.有研究表明，藻红蛋白对人宫颈癌Hela细胞的生长有显著的抑制作用并有明显的剂量依赖关系.藻红蛋白能将Hela细胞周期阻滞在G2/M期，抑制细胞增殖并诱导细胞调亡[4-5].

本实验是研究不同剂量的藻红蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制及凋亡作用，并通过检测藻红蛋白对细胞内线粒体膜电位变化来研究藻红蛋白是如何诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的.实验中，MTT结果显示藻红蛋白对MCF-7细胞具有一定的细胞毒作用，且随着龙藻红蛋白质量浓度的增大而抑制作用增强，其对MCF-7细胞的IC50值为81.60μg/mL.通过倒置显微镜观察在藻红蛋白直接作用人乳腺癌MCF-7细胞48 h后，阴性对照组细胞排列相对紧密，无细胞变形破碎，随给药浓度增加细胞生长密度逐渐变疏，细胞皱缩，高浓度组大部分细胞破碎，细胞形态不完整，贴壁减少.说明藻红蛋白对MCF-7细胞是有凋亡作用的，并呈剂量依赖关系.Hoechst33258染色以后，荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈现均匀的蓝色荧光，而凋亡细胞的细胞核则呈现出致密浓染或为碎块状浓染荧光.本实验结果提示，藻红蛋白作用于MCF-7细胞48 h后细胞形态发生变化，随着剂量增加出现细胞凋亡现象，阴性对照组结果显示MCF-7细胞染色质均匀，核形态规则，中剂量给药组细胞核出现碎片，高剂量给药组细胞核则呈致密浓染，这表明藻红蛋白可导致MCF-7细胞形态学发生改变.本实验利用碘化丙啶(PI)单染通过流式细胞仪检测分析表明不同质量浓度的藻红蛋白作用MCF-7细胞48 h后，有明显凋亡峰出现，各组细胞凋亡率由低剂量组25.18%到中剂量55.45%到高剂量83.94%随着药物质量浓度增加而升高.进一步说明藻红蛋白对MCF-7细胞的抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关.细胞凋亡的早期指标之一就是线粒体跨膜电位变化，而贯穿线粒体内膜和外膜的通道是PT孔[6-7].PT孔开放导致线粒体电子传递链与氧化磷酸化解偶联、膜电位降低、ATP合成减少、还原性谷胱甘肽减少、细胞内活性氧增多，导致线粒体基质膨胀，外膜皱襞少，表面积小，易于破裂，释放出膜间促凋亡蛋白，最终引起细胞凋亡[8-9].本实验通过激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化，不同质量浓度PE对MCF-7作用48h后，线粒体膜电位荧光强度分别为24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白组的膜电位为28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7细胞的线粒体膜电位，线粒体膜电位呈剂量性降低，因为线粒体膜电位是反映了线粒体功能的完整性，是评价线粒体功能的重要指标，随着给药质量浓度的增加，线粒体膜完整性被破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体膜电位的下降，最终细胞凋亡[10-11].

综上所述，本研究提示藻红蛋白对MCF-7细胞具有一定的细胞毒作用以及藻红蛋白可降低MCF-7细胞内线粒体膜电位，初步断定藻红蛋白可以诱导MCF-7细胞凋亡，但是通过何种凋亡途径还有待进一步的研究.

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