犬细小病毒自家灭活疫苗的血凝抑制抗体测定

(公安部沈阳警犬技术学校，辽宁沈阳 110034)

犬细小病毒病是由犬细小病毒感染引起的一种急性传染病 ,以剧烈呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征 ,并可引起犬急性心肌炎,症状与猫泛白细胞减少症相似 ,是危害我国养犬业最为严重的传染病之一。

目前，该病的预防，国内仍倾向于使用CPV灭活苗和弱毒苗。在辽宁地区发生细小病毒病的仔犬病料经过电镜及PCR检测，发现疑似细小病毒变异株，确定变异的基因片段还需进一步做病毒分离及细胞培养实验。目前市售疫苗中无一种能对细小病毒病起较强的保护作用。所以，一种特殊的免疫措施—自家灭活疫苗，不失为犬场传染病流行、紧急状态下的紧急控制措施。

自家灭活疫苗就是取发病犬群中的犬组织，加工做成灭活疫苗。本研究通过对部分仔犬群进行自家灭活疫苗免疫，测定免疫后的细小病毒抗体水平，并通过实际的免疫效果检验免疫程序，以指导犬细小病毒病的控制工作。

1 试验方法

随机选择试验犬30头，分别在仔犬免疫前、首免后15 d、二免后15 d抽取仔犬血样，应用CPV HA-HI试验诊断技术对抗体水平进行检测，进行免疫效果分析。

2 试验过程

第一步 选择健康状况良好、体重相仿的30头仔犬作为试验犬。随机选择15头为试验组，注射自家灭活疫苗；另15头为对照组，注射市售疫苗。

第二步 当仔犬达30日龄时，当日清晨前肢静脉采血2 ml。

第三步 新鲜血液3000 r/min，离心10 min，析出血清。先用PBS液稀释5倍，并于56℃水浴灭活30 min，待凉。

第四步 配备5 mL/L(0.5%)猪红细胞悬液。

第五步 次日，将稀释后的备用血清加入1/10待检血清体积的试验用猪红细胞，摇匀后室温吸收(至少)2 h，3000 r/min，离心10 min，取上清液待检。

第六步 采用微量法在96孔型板上进行，用25 μL移液管向第一排的1～9、11、12孔内各吸取25 μL混合液移至第2孔，充分吸吹混合，再吸取25 μL混合液移至第3孔，如此循环到第9孔，最后吸取第9孔的混合液25 μL弃去。第10、11孔不加待检血清。第12孔滴加25 μL待检血清。再向1～9孔和11孔中滴加25 μL血凝抗原(含4个HA单位)，10、12孔不加，37℃作用30 min后向1～12孔各滴加50 μL 0.5%猪红细胞悬液。所有试验均在2～4℃下进行，直至红细胞对照清亮，一般4 h后观察结果。每一组包括红细胞对照、血凝抗原对照和待检血清对照。

第七步 分别在仔犬首免后15 d、二免后15 d重复以上操作过程。

3 试验结果

详见表1。本试验是对CPV抗体效价的定性测定，一般1∶80是抵抗CPV的保护效价。

表1 仔犬CPV抗体效价

由表1可见，免疫前，试验组与对照组抗体效价均为1∶80以上，无明显差异。此后，试验组经过二次免疫后效价明显增高，而对照组显然疫苗未起作用。

根据试验，应用ELISA方法检测分析CPV血清效价，结果表明使用自家灭活苗免疫，短期内就能起到对犬细小病毒的保护作用。

4 讨 论

4.1根据细小病毒出现的变异株及目前国内外市售疫苗不能有效保护细小病毒病之故，使用自家灭活疫苗救急，效果理想。据试验，自家灭活疫苗主要具有以下优点。

一是具有多种抗原成分。由于用于制备自家组织灭活苗的病料采自发病犬群，其中抗原成分基本包括了本群存在的病原，比较符合免疫保护与疾病控制要求，较全面的抗原有可能在一定程度上诱导全方位的保护力，这是—般单苗难以达到的。

二是犬体组织细胞成分的特殊作用。这只是一种假设。自家组织疫苗中的主要成分是犬体组织细胞，各种病原抗原的含量相比之下是次要的。解剖用过自家组织灭活苗免疫的犬只常能发现，全身淋巴系统增生，淋巴结肿大明显。

三是免疫筛选作用。实施该免疫措施后，由于大量抗原的引入，犬只机体处于持续较强免疫应激状态，抵抗其它病原或环境变化的能力降低，于是优胜劣汰，加速部分体况差犬、带毒犬、亚健康犬表现症状，从而可尽早识别淘汰，使疾病得到缓解。

4.2多数仔犬在6～8周龄(最长14周龄)时，母源抗体迅速减少或消失,一般1∶80是抵抗CPV的保护效价。一般幼犬3周龄内很少感染CPV,3周龄后、幼犬母源抗体<1∶80，对CPV最易感。

4.3因CPV对外界理化因素抵抗力较强，粪便中的CPV可存活数月至百年；并且细小病毒病具有高度传染性；40日龄仔犬易感性最强、病死率较高。所以选取仔犬作为研究对象。整个试验过程采用血凝抑制试验，其实验原理及实验路线非常成型。根据细小病毒具有较强的血凝活性，在4℃和25℃均能凝集猪红细胞这一特性。但血凝可受很多外在条件的影响(温度影响)，因此在具体实验中，必须探索出血凝可获得高滴度结果的温度条件。