基于氧化石墨烯淬灭效应的DNA传感器特异性检测三聚氰胺

李 静 裴 昊 李 凡 王丽华 樊春海

（中国科学院上海应用物理研究所 上海 201800）

三聚氰胺(C3H6N6, Melamine, Mel)是广泛应用于塑料工程和农业的原料。近年来，三聚氰胺在食品中的违规添加造成严重后果，引起人们的普遍关注[1,2]。C3H6N6是含氮量很高的三嗪类杂环化合物，每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%的蛋白质含量。常规的凯氏定氮法等全氮测定法无法检测出三聚氰胺，故曾在牛奶和奶粉里过度添加[3,4]。三聚氰胺进入体内会损害生殖、泌尿系统，如膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。现有检测方法如气质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、表面增强拉曼光谱(SERS)、液相色谱串联质谱(LC-MS/ MS)等有较高灵敏度，但它们均系大型精密仪器、对实验环境及操作人员要求较高、检测时间过长，限制了它们在实际检测中的应用[5–7]。

本文提出一种快速检测方法，其基于氧化石墨烯(graphene oxide, GO)的淬灭效应。GO是新型的纳米材料，其独特的物理化学和光学性质，在生物传感方面的应用十分广泛[8–10]。研究表明，GO可吸附单链DNA形成GO-DNA复合物，并有效淬灭DNA标记染料(如 Fam)的荧光[11–13]。基于三聚氰胺中六元环的平面结构，推测它可与GO表面发生较强作用。三聚氰胺的加入导致其与DNA在GO表面发生竞争，DNA从GO表面脱落进入溶液中，荧光得以恢复。具体为选择一段长度为15 bp、Fam标记的单链DNA序列，通过与GO的吸附形成GO-DNA复合探针，此时Fam-DNA的荧光被有效淬灭。加入三聚氰胺后，荧光得到恢复。图1为GO-DNA传感器检测三聚氰胺示意图。

图1 基于GO/Fam-DNA的传感器检测三聚氰胺Fig.1 The principle of Melamine detection with the GO/Fam-DNA sensor.

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

三聚氰胺溶液的配制：取21 mg粉末溶于1 mL 20%的甲醇/水溶液中，终浓度为 167 mmol/L；Fam-DNA 序列为 Fam-TGCGAACCAGGAATT(上海英潍捷基贸易有限公司，HPLC纯化)，用Milli Q水制成10 μmol/L的母液备用；GO依据文献[14–16]合成；1×PBS、麦芽糖、葡萄糖、果糖(上海生工生物工程有限公司)；F-4500荧光分光光度计(Hitachi，日本)；荧光比色皿(宜兴市玻璃器皿厂)。

1.2 验证氧化石墨烯与Fam-DNA的相互作用

取5 μL浓度为10 μmol/L的Fam-DNA，置于995 μL 的 1×PBS 缓冲液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L PB，pH 7.4)中混匀，将比色皿放入荧光分光光度计中，设置参数为激发波长为494 nm，发射波长范围为504–650 nm[17–20]，电压为950 V，狭缝宽度为5 nm，记录Fam-DNA(终浓度50 nmol/L)的荧光光谱。然后向比色皿中加入 5 μL GO(0.47 mg/mL)，混匀后再次记录荧光光谱。通过比较加入GO前后荧光光谱的变化，验证GO与Fam-DNA之间的相互作用以及GO-DNA复合物是否形成。

1.3 三聚氰胺的特异性和灵敏度研究

在含有50 nmol/L Fam-DNA、5 μL GO的1 mL溶液中，加入不同体积的三聚氰胺(167 mmol/L)，并使终浓度分别为0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.66、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L，记录荧光光谱，考察三聚氰胺的的检测范围和检测限。在特异性分析中，选择了0.0668 mmol/L三聚氰胺和10 mmol/L的葡萄糖、麦芽糖、果糖进行分析，考察其特异性。

2 结果

2.1 GO-DNA传感器检测三聚氰胺

图2为DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的荧光光谱图。

图2 DNA、GO-DNA以及GO-DNA/Mel的荧光光谱图Fig.2 The fluorescence spectra of DNA, GO-DNA and GO-DNA/Mel.

50 nmol/L Fam-DNA的荧光光谱图在波长525 nm处荧光值为2431(■)。此时，加入三聚氰胺，荧光值略升高，变化不大(★)。当加入5 μL GO(0.47 mg/mL)后，荧光值迅速下降至103(●)，淬灭效率达95.8%。结果说明，Fam-DNA被吸附到GO表面，并拉近了Fam与GO的距离，导致荧光被GO有效淬灭，该现象与文献[21–23]报道一致。而加入13.36 mmol/L三聚氰胺后，三聚氰胺将 GO表面的Fam-DNA 取代，荧光值重新升至 1685(▲)，上升16.4倍。该数据有效地证实了当GO与Fam-DNA距离较近时，GO可以淬灭Fam-DNA荧光，使荧光值迅速下降；而三聚氰胺能够取代 GO表面的Fam-DNA，使Fam-DNA与GO距离变大，荧光值升高；所以，通过荧光值的变化可以检测三聚氰胺，即用GO-DNA传感器检测三聚氰胺的方法可行。

2.2 三聚氰胺检测的特异性和灵敏度分析

为证明三聚氰胺检测方法的特异性，我们进行了空白分析和对照分析，对三聚氰胺、三种对照样品及空白对照结果见图3，其纵坐标为加入样品前后的荧光增加值ΔF=F–F0。由图3可见，10 mmol/L麦芽糖(Mal)、葡萄糖(Glu)和果糖(Fru)的加入导致荧光值有小幅升高，说明它们与GO的相互作用较弱，只有少量的DNA分子从GO表面脱落。而0.0668 mmol/L三聚氰胺的加入导致荧光值升高了143，信噪比为10左右，表明三聚氰胺与GO表面存在着强相互作用。这种GO与三聚氰胺的独特作用，很易区分三聚氰胺与其它分析物，实现特异性检测。

图3 GO-DNA传感器特异性检测三聚氰胺Fig.3 Selectivity of melamine detection by the GO-DNA sensor.

图4给出了基于GO/Fam-DNA的传感器在检测不同浓度三聚氰胺的荧光变化情况。在含有Fam-DNA和GO的检测体系中，加入不同浓度的三聚氰胺(0、0.0668、0.668、1.34、2.00、3.34、4.68、6.68、10.02、13.36、20.04 mmol/L)。由图4(a)，荧光值随三聚氰胺浓度而升高，到13.36 mmol/L时达到最高。对荧光值与三聚氰胺浓度进一步进行分析，三聚氰胺的线性检测范围为0.0668–1.336 mmol/L，最低检测到 6.68×10–5mol/ L 三聚氰胺(图4b)。检测三聚氰胺的其它方法检测限：ELISA(免疫检测法)最低检测限为1 μg/mL，但复杂，检测时间长，不如本方法简便、快速。

综上所述，利用 GO-DNA传感器检测三聚氰胺，具有很好的特异性和灵敏度，整个检测过程简便快速，适合大批量样品的现场分析。

图4 基于GO-DNA的传感器检测不同浓度三聚氰胺Fig.4 GO-DNA based sensor for detection of various concentrations of melamine.

3 结语

“三鹿奶粉事件”等类似事件的发生对三聚氰胺的检测提出了更高的要求[18]。本工作提出了一种基于GO-DNA的检测方法，并实现了三聚氰胺的快速、灵敏检测。该方法主要是基于GO与Fam-DNA、三聚氰胺的相互作用差异，并通过 DNA和三聚氰胺在GO表面的竞争吸附来实现三聚氰胺的检测。与传统方法相比，基于GO的荧光检测方法具有以下优点：(1) 操作简便，对检测人员技能及检测环境要求不高；(2) 不需要大型精密仪器，成本低；(3)分析时间短，可以快速得到实验结果；(4) 特异性高，可以特异性检测三聚氰胺，因此检测样品不需要复杂的前处理，可以直接检测，节省分析时间；(5) 灵敏度较好，可以检测 0.0668 mmol/L三聚氰胺；(6) 检测精确度高，重复性好；(7) 实用性好，该方法可用于实际样品的检测。 因此，GO-DNA传感器可以快速、准确、特异地检测三聚氰胺，是一种有效检测三聚氰胺的新方法。

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