基于糖显色法测定鼠李糖含量的方法研究

张祥胜,张玉辉,戴翠娥,许德军

（1.盐城师范学院生命科学与技术学院,江苏盐城224002；2.河南科技学院,河南新乡453003）

鼠李糖脂主要是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在好氧条件下产生,是目前研究最多的一种生物表面活性剂.与化学合成的表面活性剂相比,它除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、易生物降解等特性,有利于环境保护.因此它在石油开采业、食品工业、环境生物修复以及农业中的应用前景得到了广泛的认可[1-3].快速测定发酵液中鼠李糖脂的含量是筛选高产菌株的基础.

糖脂类表面活性剂含量的测定方法已有较多报道[4-7],多采用苯酚-硫酸法、苔黑酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等方法测定,其中苯酚-硫酸法较为常用[6].笔者采用这3种方法测定鼠李糖脂含量,并通过比较其精确度确定最佳方法,为下一步便捷、准确的筛选打下基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器 双光束紫外可见分光光度计,紫外分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）.

1.1.2 药品 苯酚、硫酸、苔黑酚、蒽酮均为国产分析纯,鼠李糖脂样品购自浙江湖州紫金生物技术有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 试剂的配制

鼠李糖脂溶液的制备：称取干燥恒重的鼠李糖脂1.25 g放置于小烧杯中,用50 mL甲醇溶解,静置一段时间后取其上清液,用甲醇定容于50 mL量瓶中,将小烧杯及杯中剩余的鼠李糖脂烘至恒重,配制成质量浓度为15 g/L的鼠李糖脂母液.

苯酚试剂的配制：苯酚用水浴加热后溶解,称取100 g,加铝片0.10 g,氢氧化钠0.05 g,蒸馏收集182℃的馏分.取馏出液5.00 g,加水100 mL,置于棕色瓶中,备用.

苔黑酚试剂的配制：取0.19 g苔黑酚溶解于100 mL体积分数为53%的硫酸中,置于棕色瓶中,备用.蒽酮试剂的配制：取0.20 g蒽酮溶解于100 mL体积分数为85%的硫酸中,置于棕色瓶中,备用.

1.2.2 测定方法

苯酚-硫酸法：将鼠李糖脂母液用甲醇分别稀释200倍、160倍、100倍、80倍、40倍,用容量瓶定容,即质量浓度分别为75、93.75、150、187.5、375 mg/L.分别取2 mL各浓度的溶液于相对应的试管中,将试管置于沸水浴中使甲醇完全蒸发,各试管补去离子水至2 mL,空白对照补水至2 mL,每个试管加1mL质量分数为5%的苯酚试剂,充分振荡后沸水浴15 min.用自来水冷却至室温,在双光束紫外可见分光光度计中扫描,得到其吸收峰λ=479 nm.使用紫外分光光度计在λ=479 nm处测各浓度的吸光度,并记录.

苔黑酚-硫酸法：取鼠李糖脂的质量浓度梯度为50、100、150、200、250 mg/L.按每200 μL鼠李糖脂溶液加1.8 mL苔黑酚试剂,空白补去离子水至所加样液量.充分振荡后沸水浴15 min.用自来水冷却至室温,在双光束紫外可见分光光度计中扫描,得到其吸收峰λ=421 nm.使用紫外分光光度计在λ=421 nm处测各浓度的吸光度,并记录.

蒽酮-硫酸法：将鼠李糖脂母液用甲醇分别稀释200倍、100倍、40倍、20倍、10倍,用容量瓶定容,即质量浓度分别为75、150、375、750、1 500 mg/L.分别取1 mL样液至对应的试管中,置于水浴中,使甲醇完全蒸发,加4 mL蒽酮试剂,于冰水浴中加1 mL去离子水,空白加蒽酮试剂后于冰水浴中加去离子水.用自来水冷却至室温,在双光束紫外可见分光光度计中扫描,得到其吸收峰λ=586 nm.使用紫外分光光度计在λ=586 nm处测各浓度的吸光度,并记录.

2 结果与分析

2.1 鼠李糖脂标准曲线的绘制

2.1.1 苯酚-硫酸法 以吸光度值为纵坐标,鼠李糖脂质量浓度为横坐标,做回归处理[8],绘制标准曲线（见图1）,线性回归得鼠李糖脂的标准曲线方程Y=0.003 64X-0.096 07,相关系数R2=0.991.

图1 苯酚-硫酸法测定鼠李糖脂浓度的标准曲线Fig.1 Standard curve of rhamnolipid measuring by phenol-sulfuric acid method

2.1.2 苔黑酚-硫酸法 以吸光度值为纵坐标,鼠李糖脂质量浓度为横坐标,绘制标准曲线（见图2）,线性回归得鼠李糖脂的标准曲线方程Y=0.003 27X+0.016 38,相关系数R2=0.998 88.

图2 苔黑酚-硫酸法测定鼠李糖脂浓度的标准曲线Fig.2 Standard curve of rhamnolipid measuring by orcinol-sulfuric acid method

2.1.3 蒽酮-硫酸法 以吸光度值为纵坐标,鼠李糖脂质量浓度为横坐标,绘制标准曲线（见图3）,线性回归得鼠李糖脂的标准曲线方程Y=0.001 01X+0.003 62,相关系数R2=0.996 86.

图3 蒽酮-硫酸法测定鼠李糖脂浓度的标准曲线Fig.3 Standard curve of rhamnolipid measuring by anthrone-sulfuric acid method

2.2 3种方法精确度的比较

随机取几个鼠李糖脂的浓度,用上述3种方法测定,使其吸光度值在1.5以内,以保证在线性范围内.将各自的吸光度值代入相应的线性关系曲线,得出鼠李糖脂的含量与配制的浓度进行比较,得出精确度较高的方法.3种方法精确度的比较见表1.

表1 3种方法精确度的比较Tab.1 The comparison of accuracy of three methods

由表1可知,3种测定方法中以蒽酮-硫酸法的精确度最好.

3 结论

鼠李糖脂作为生物表面活性剂在生产生活中已经受到很大的关注,并逐渐应用于实践,探求简单便捷的测鼠李糖脂浓度的方法已成为重要的研究内容.对鼠李糖脂含量测定方法的研究很多,苯酚-硫酸法是一般实验室常选用的方法,其技术和原理都已经很成熟.齐香君等[9]的研究表明蒽酮-硫酸法具有更高的精确度和可信度.本试验用蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和苔黑酚-硫酸法测定了鼠李糖脂的含量,结果也表明在对鼠李糖脂进行定量分析时,蒽酮-硫酸法优于苯酚-硫酸法和苔黑酚-硫酸法.

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