酿酒酵母的原生质体诱变育种

杨 鑫，胡家俊，方尚玲

湖北工业大学工程技术学院，湖北武汉 430068

酵母菌的菌落与细菌有相像的特征，但酵母菌的菌落小而薄，酵母菌的菌落质地均匀，表面平整，粘稠，酵母菌的各个部位的颜色都很平均。酵母菌发酵所需的条件就是其生长发育和繁殖所需的条件，因为酒精发酵只有在酵母菌出芽繁殖的条件下才能进行，而当发酵停止得时候，酵母菌就会停止生长并死亡。

1 试验材料

1.1 样品

酿酒酵母：实验室冷冻保藏菌株。

1.2 培养基

液体YPD培养基；固体YPD培养基；TTC上层培养基；TIC下层培养基；发酵培养基；高渗再生完全培养基；渗透压稳定剂；蜗牛酶酶液；脱壁预处理剂

2 方法

2.1 酵母菌原生质体形成与再生条件研究

2.1.1 酵母菌原生质体制备[1]

在YPD培养基斜面上将菌株活化并分别接种于三角瓶中，30℃振荡培养至对数生长前期。将上述培养液3500r/min离心10min。为了尽可能的避免含有杂质，将使用无菌水冲洗离心。将亲本细胞悬浮脱壁预处理溶液中，振荡，离心收集菌体。将菌体悬浮于3mL的蜗牛酶液中，30℃振荡培养。对其原生质形态进行跟踪观察，当形成率达90%以上时，停止反应，收集原生质体细胞，对其进行离心和冲洗以后将细胞悬浮于渗透压稳定剂中。

2.1.2 酵母菌原生质体形成与再生条件正交试验

从表1可以知道酵母菌原生质体形成与再生的最佳条件是通过酶解时间，蜗牛酶浓度，选取脱壁预处理时间这三个因素的三水平正交试验得来的。

表1 正交试验因素水平表

2.1.3 酵母菌原生质体形成率与再生率[2]的计算

1）总菌落数；

2）未形成原生质体的菌落数；

3）酶处理后未形成原生质体的菌落数和原生质体再生的菌落数之和：

原生质体形成率（%）=（A-B）/A×100%原生质体再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%

2.2 原生质体紫外诱变育种

2.2.1 酵母菌原生质体紫外诱变株[3]的筛选

取原生质体菌悬液于无菌平皿中，对原生质体细胞进行紫外诱变，将照射后的菌液直接涂布于高渗再生平板和固体YPD平板，置于30℃避光恢复培养。然后将菌落分别接种于斜面平板。

1）初筛（TTC法）

在一定培养基上培养的酵母菌落上与TTC显色剂会呈现不同的色差反应，当颜色为白色时，可能为野生菌落，当颜色为深红时，可能是产量高的菌落，当为粉红时可能产量要弱些。在TTC下层培养基中接入诱变后的菌株，培养24h，长出菌落，然后倒入TTC上层培养基，30℃下保温（阴暗处）2h～3h。比较各菌株之间的产酒精能力。

2）复筛

将含有发酵培养基的三角瓶中接入初筛时使用TTC法筛出的的优良菌株并按10%的比例接入酵母菌株，于30℃下静止发酵。每隔12h测一次二氧化碳失重，72h后可以认为发酵结束，发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖。

2.2.2 各参数的测定方法

1）残还原糖量[4]：DNS法；2）发酵醪液酒精浓度[5]：蒸馏法；3）二氧化碳失重的测定：直接称重法。

3 结果与讨论

3.1 酵母菌原生质体形成与再生条件研究

表2 酵母菌原生质体形成与再生正交试验结果

酵母菌原生质体形成与再生正交试验结果：

由表2可知，在脱壁预处理20min，然后1%的蜗牛酶酶解0.5h的条件下，得出原生质体形成率为和再生率分别为89.7%和19.3%。

3.2 诱变株的筛选

为保证得到性状优良的突变菌株，本试验采用了紫外诱变方法对酵母菌株进行原生质体诱变。最终从再生平板中共得到20株诱变株。经过初筛（TTC法）得到5株呈现深红色的酵母菌落。再将这5株菌株经过复筛得到各个菌株的发酵特性。

表3 诱变株的筛选

由表3可知，相对于出发菌株W酒精产量有所提高的诱变株有3株，占所有突变株的比例为15%。其中突变株W9产酒精量最高，为6.0%，相对于出发菌株W产酒精量提高了22.95%。残还原糖含量为6.08mg/mL，相对于出发菌株W的6.35mg/mL，相差不大。负突变株W10产酒精量最低，仅为4.12%。

4 结论

1）通过对原生质体形成与再生正交试验而得到最佳条件如下：在先脱壁预处理20min，然后1%的蜗牛酶酶解30min的条件下，得出原生质体形成率为和再生率分别为89.7%和19.3%；

2）通过初筛和复筛，获得5株在发酵性能上优越的菌株，初筛中的定性筛选是一个高通量的分析，明确删除不符合要求的发酵能力弱的菌株。复筛是一个定量分析，可以将高产酒精的菌株给筛出。本次试验在筛选的初筛中加入了TTC显色剂，因此在初筛的时候删去发酵能力弱的菌株，减少了复筛的使用率，说明TTC对于筛选高产酒精酵母菌也很有用；

3）采用原生质体紫外诱变方法，选育得到一株遗传性状稳定的突变株W9，发酵72h后，其成熟醪酒精体积分数为6.0%，残还原糖含量为6.08mg/mL，对比出发菌株W，W9产酒精量提高22.95%。

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