结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达模型的建立及鉴定

董江涛，徐芳，田玺择，姚楠，吴芳，章乐，王远志，曹旭东，张万江

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达模型的建立及鉴定

董江涛，徐芳，田玺择，姚楠，吴芳，章乐，王远志，曹旭东，张万江

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

为了建立及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达的模型。采用将0．3mL浓度约为1．0×107个／mL结核分枝杆菌菌悬液经昆明小鼠尾静脉注射，复制结核分枝杆菌感染小鼠模型，经鉴定小鼠感染模型复制成功后第15天，进行小鼠肺泡的灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，获取感染小鼠肺泡巨噬细胞，以提取的感染小鼠肺泡巨噬细胞内的结核分枝杆菌基因组DNA为模版PCR扩增结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的基因，同时进一步利用激光共聚焦显微镜观察小鼠肺泡巨噬细胞的方法进行研究。PCR结果证实感染结核分支杆菌的巨噬细胞内有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3的基因表达；同时激光共聚焦显微镜下可见感染小鼠肺泡巨噬细胞内吞噬有大量结核分枝杆菌，并且证实有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3的分泌表达。成功建立了结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达的模型。

结核分枝杆菌；肺泡巨噬细胞；结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3；表达；模型

结核病是单基因所致感染性疾病中死亡率最高的疾病，据2005年报道，全球有近1／3的人（即20亿人口）已感染结核杆菌，每年死于结核病的人数达200万人。据世界卫生组织（world health organization，WHO）统计，全球二十二个结核病高负荷国家中，中国仅次于印度，居世界第二位，其中约有460万人为活动性肺结核［1］。因此我国的结核病防治工作面临着严峻的考验；迫切需要对结核病进一步研究，以控制近年来发病率不断增高的态势。结核病的致病菌——结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，主要在巨噬细胞等宿主免疫系统的细胞内存活和繁殖。研究发现，结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3是一个组成性表达蛋白，正常条件下仅有少量表达，感染巨噬细胞后，表达量增加，结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的表达则可能与结核分枝杆菌在宿主体内的休眠机制有关［2］。因此，建立结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达模型，为深入研究结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3在结核病发病机制中的作用，阐明结核病的发病机制奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 昆明种小鼠，6～8周龄，体重（18±2）g，购自石河子大学实验动物中心。

1．1．2 所用菌株 结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株购自中国药品生物制品检定所。

1．1．3 主要试剂与仪器设备 Mycobacterium tuberculosis 16kDA antibody［HTM63］（只针对结核分枝杆菌的16kDA的小鼠单克隆抗体）、荧光二抗（山羊抗小鼠）、激光共聚焦显微镜、生物安全柜、PCR仪。

1．2 方法

1．2．1 实验分组 实验分3组：结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株组、卡介苗菌株组和空白对照组。

1．2．2 菌悬液的制作和结核分枝杆菌感染小鼠模型复制及鉴定 在生物安全柜内，用接种环挑取，在改良罗氏固体培养基上生长2～3周的状态良好的结核分枝杆菌菌落，放入高压灭菌好的磨菌器中，加入少量0．05%Tween－20的生理盐水充分研磨，使其成均匀浑浊的菌悬液。通过麦氏比浊法调整细菌浓度约为1．0×107个／mL。然后经小鼠尾静脉将不同的菌悬液分别注射到对应分组的小鼠体内，每只小鼠的菌悬液注射量约为0．3mL，对照组注射同等量的生理盐水。感染结核分枝杆菌后的小鼠必须要在生物安全三级实验室内，IVC笼具中饲养。

1．2．3 感染模型小鼠肺泡巨噬细胞的收集及培养

参照文献［3］的方法，并加以改进。感染15d的实验小鼠，经眼球后放血后，脱颈处死，暴露支气管，用消毒好的剪刀在气管上做一切口（切勿剪断），用连有注射器的无菌软皮管从切口处插入气管，丝线固定，用4℃预冷PBS液行气管肺泡灌洗，每次1 mL，共10次，离心管收集支气管肺泡灌洗，4℃1500r／min离心10min，倒掉上清液加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，转入细胞培养瓶中。置37℃，5%CO2孵箱中培养4h，贴壁细胞即为小鼠肺泡巨噬细胞。3组小鼠均按上述操作，分别收集结核分枝杆菌感染小鼠的肺泡巨噬细胞。

1．2．4 利用激光共聚焦显微镜技术检测各组结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的表达 （1）细胞制备：收集小鼠肺泡巨噬细胞，用10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，将细胞悬液均匀铺到六孔板（内置预先灭菌处理过的盖玻片）中，置于37℃，5%CO2孵箱中培养4h。（2）细胞固定：取出盖玻片，用PBS侵洗，然后放入4%多聚甲醛固定液中，室温下静置固定15min，蒸馏水冲洗3次。（3）固定好的细胞玻片放入湿盒中，滴加山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，勿冲洗。（4）滴加稀释后的一抗，均匀铺在玻片上，湿盒内放置，4℃过夜。（5）PBS冲洗3min×3次，滴加荧光二抗，室温2h，PBS冲洗干净，硝酸甘油封片。（6）激光共聚焦显微镜观察荧光强度及着色部位。

1．2．5 结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3基因的扩增 （1）小鼠肺泡巨噬细胞内吞噬的结核分枝杆菌基因组DNA的提取于感染模型复制成功后第15天，收集不同感染组的小鼠肺泡巨噬细胞（方法同前），参考文献［4］中的具体操作步骤，分别提取结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株的基因组DNA。

（2）引物的设计与合成 根据GenBank中结核分枝杆菌Hsp16．3基因序列设计引物，序列如下：

上 游 引 物：5′－CGCGGATCCATGGCCACCACCACCCTTC－3′，

下游引物：5′－CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG－3′。

引物由上海生工生物工程公司合成。

（3）分别以提取的结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA和BCG基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系参数为：94℃5min；94℃45 s，62℃ 45s，72℃ 50s，共30个循环，72℃ 10 min。待反应完毕，取5μL PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物纯化按照文献［5］及试剂盒说明书进行，纯化后的PCR扩增产物送公司做基因测序鉴定。

2 结果与分析

2．1 结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3基因的扩增

以提取的感染小鼠肺泡巨噬细胞内的结核分枝杆菌基因组DNA为模版，PCR扩增结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的基因，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，均显示为大小约435bp的特异性扩增条带，见图1。

图1 结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3基因的PCR扩增产物Fig．1PCR products of gene HSP16．3of Mycobacterium tuberculosis

PCR产物纯化并送北京六合华大基因公司测序。基因测序结果与GenBank数据库所收录的Hsp16．3基因一致。表示结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株被宿主巨噬细胞吞噬后均伴有小分子热休克蛋白HSP16．3的表达。

2．2 利用激光共聚焦显微镜技术检测各组结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的表达

在激光共聚焦显微镜下观察到：结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬细胞内均可见大量绿色荧光（图2、图3），仅用生理盐水的对照组则未见绿色荧光。图4表明结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬，同时均伴有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3的表达。

图2 结核分枝杆菌H37Rv菌株感染小鼠模型复制鉴定后第15天，所提取的小鼠肺泡巨噬细胞在激光共聚焦镜下的形态学观察（400×）Fig．2Infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain 15days later identification copied，extracted mouse alveolar macrophages in the confocal microscope morphology（400×）

图4 注射生理盐水的小鼠第15天，所提取的小鼠肺泡巨噬细胞在激光共聚焦镜下的形态学观察（400×）Fig．4Mice injected with saline 15days later，the extracted mouse alveolar macrophages in the confocal microscope morphology（400×）

3 讨论

结核病的致病菌—结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，主要在巨噬细胞等宿主免疫系统的细胞内存活和繁殖，但目前机体抗结核的免疫机制尚不清楚，有待进一步的探索和研究。

C57BL／6J品系小鼠和昆明小鼠可用作建立结核分枝杆菌感染实验的动物模型。虽然就近交系和远交系而言，C57BL／6J系小鼠是结核分枝杆菌实验动物模型的首选［6］，但昆明小鼠对结核分枝杆菌也具有很强的敏感性。研究发现结核分枝杆菌感染宿主后，随着机体抗结核免疫效应的建立，巨噬细胞通过自身的凋亡达到杀死和清除结核分枝杆菌的目的，巨噬细胞凋亡率逐渐升高，一般在10d内即可达到顶峰。然后逐渐降低，至感染第15天结核分枝杆菌大多以休眠状态存在于巨噬细胞中，形成所谓的“逃避”，使自身的存活、繁殖与宿主的一系列免疫反应达到一种动态平衡［7］。结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的表达则可能与结核分枝杆菌在宿主体内的休眠机制有关，本实验研究是用结核分枝杆菌菌悬液经昆明小鼠尾静脉注射，复制结核分枝杆菌感染小鼠模型，经鉴定小鼠感染模型复制成功后第15天，进行小鼠肺泡的灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，获取感染小鼠肺泡巨噬细胞，进一步利用激光共聚焦显微镜观察小鼠肺泡巨噬细胞，以提取的感染小鼠肺泡巨噬细胞内的结核分枝杆菌基因组DNA为模版，PCR扩增结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3基因。利用激光共聚焦显微镜下观察到，结核分枝杆菌H37Rv菌株组和BCG菌株组的大部分小鼠肺泡巨噬细胞内均出现了特异性抗体标记的绿色荧光，而对照组无荧光出现。结果表明：感染小鼠肺泡巨噬细胞内吞噬有大量结核分枝杆菌，并有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3的分泌表达，同时PCR结果证实有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16．3的基因表达。PCR扩增产物，经纯化后测序，结果与GenBank数据库收录的Hsp16．3基因一致，表明结核分枝杆菌H37Rv菌株和BCG菌株被宿主巨噬细胞吞噬后均伴有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的表达。

近年来关于结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞并诱导自身表达合成结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3的研究国内外鲜有报道。本研究成功建立了结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3分泌表达模型，为深入研究结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16．3在结核病发病机制中的作用，阐明结核病的发病机制奠定基础。

［1］Mitra G，Saha A，Gupta T D，et al．Chaperone－mediated inhibition of tubulin self－assembly［J］．Proteins，2007，67（1）：112－120．

［2］Fu X，Chang Z．Identification of bis－ANS binding sites in Mycobacterium tuberculosis small heat shock protein Hsp16．3：evidences for a two－step substrate－binding mechanism［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，349（1）：167－171．

［3］陈秀芳，金丽琴，吕建新，等．蝉拟青霉对大鼠腹腔及肺泡巨噬细胞的激活作用［J］．中国病理生理杂志，2002，18（6）：694－697．

［4］Zhang ZQ，Muhammad I．Evaluation of methods for isolation of DNA from slowly and rapidly growing Mycobacteria［J］．International Journal of Leprosy，1997，65（4）：469－476．

［5］Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T，et al．分子克隆实验指南·第2版［M］．北京：科学出版社，1996，674－676．

［6］卢润生，漆浩珊，刘杨椅，等．结核菌实验动物探讨［J］．中国防痨通讯，1990，12（3）：118－119．

［7］Rengarajan J，Bloom B R，Rubin E J．Genome－wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：8327－8332．

Establishment and Identification of the Expression Model of Mycobacterium Tuberculosis HSP16．3Induced by MTB－infected Alveolar Macrophages in Mice

DONG Jiangtao，XU Fang，TIAN Xize，YAO Nan，WU Fang，ZHANG Le，WANG Yuanzhi，CAO Xudong，ZHANG Wanjiang
（School of Medicine／Key Laboratory of Xinjiang Endemic ＆ Ethnic Disease of Ministry of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

To establish and identify the expression model of Mycobacterium tuberculosis HSP16．3induced by MTB－infected alveolar macrophages in mice．The study used 0．3mL M．tuberculosis suspension at a concentration of 1．0×107pieces／mL to inject the mice through tail vein to replicate models of mice infected with M．tuberculosis．15dafter the successful replication of the model，we lavaged the alveolar of mice and collected the lavaged liquid to obtain alveolar macrophages of the infected mice．The gene coding for Hsp16．3 was amplified through PCR from the DNA of M．tuberculosis in the alveolar macrophages of infected mice，and con－focal laser scanning microscopy，CLSM，was used for the observation of alveolar macrophages．The results of PCR confirmed the expression of the M．tuberculosis Hsp16．3in alveolar macrophages，and CLMS found a large number of M．tuberculosis within alveolar macrophages of the infected mice and proved the expression of M．tuberculosis Hsp16．3．This study succeeded in establishing the expression model of M．tuberculosis Hsp16．3induced by MTB－infected alveolar macrophages in mice．

Mycobacterium tuberculosis；alveolar macrophages；Mycobacterium tuberculosis HSP16．3；expression；model

R378．99

A

2011－11－02

国家自然科学基金项目（30960355，30760237）

董江涛（1983－），男，硕士生，专业方向为感染免疫；e－mail：xinxinjiangtao＠163．com。

张万江（1967－），男，教授，博士生导师，从事感染性疾病的病理生理学研究；e－mail：zwj1117＠sina．com。