桦皮素的提取纯化及其含量测定研究

王 雷，任永春，范延新，杨志兴

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨，150090;2.万生联合制药有限公司，吉林梅河口市，135000;3黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨，150001）

白桦(Betula platyphylla Suk.)为桦木科桦木属植物，在我国东北地区资源丰富，桦树皮中含有的桦皮素是一种重要的自然资源，它的药理作用受到国内外学者的广泛重视。研究表明白桦三萜类物质桦皮素为白色晶体粉末，无味，易溶于有机溶液，微或难溶于水，熔点在248～251℃（桦木醇）和316～318℃（桦木酸）。桦皮素对各类瘤株的抑瘤率达到30%以上,对黑色素瘤B16的效果最好，抑瘤率为51.4%，桦皮素可促进巨噬细胞和脾细胞分泌肿瘤坏死因子(TNE)，增加巨噬细胞的细胞毒性活性。桦皮素的生物学功能包括：抗肿瘤、抗炎抗菌、抗病毒（尤其抗艾滋病毒）、抗突变、抗衰老、抗氧自由基、抗缺氧，有戒毒作用，增加免疫机能，护肝保肝等功能[1～3]。临床试验发现，桦木酸极有可能开发成抗癌药物应用于肝癌、肠癌、胃癌的治疗[4]。另外桦皮素具有极强的抗结核杆菌作用，可用于结核病的治疗[5～8]。

从桦树皮中提取桦皮素的方法很多，本文应用乙醇提取法和乙醇与氯仿重结晶法，从桦树皮中提取桦皮素，纯度达到95%以上，该方法工艺简单、溶液普通、成本廉价、结晶容易、收率较高。同时利用高效液相色谱法测定桦木醇含量，准确快捷。本研究为桦皮素的工业化生产提供理论依据和参考。

1 实验材料与方法

1.1 仪器和药品

玻璃回流提取仪,恒温水浴,RE5205旋转蒸发器,粉碎机,LC-6A高效液相色谱仪（日本SHIMADZU）。对照品桦木醇为上海复旦大学生命科学院张教授提供。分析用试剂均购于promega公司。

1.2 方法

1.2.1 白桦树皮的预处理

干燥的白桦树皮粉碎至40目，取100g粉末用pH=12的蒸馏水浸泡，加热至100℃，保持40min，冷却并淋洗至中性，干燥备用。

1.2.2 桦木醇提取方法

以干燥的桦树皮为材料，分别以95%乙醇、苯、氯仿、甲醇作为提取溶剂，75℃回流提取2h，收集滤液，重复提取一次，合并提取液。用旋转蒸发器回收提取溶剂，至1/20体积，热过滤，4℃结晶，滤出结晶，减压干燥，得到粗品。

1.2.3 桦木醇结晶方法

粗品用8倍体积的的氯仿∶乙醇（1∶20）溶解，待完全溶解后，滤出杂质，溶液在4℃，重结晶，滤出结晶，减压干燥，得到结晶品，称重。

1.2.4 桦木醇含量的测定方法

应用高效液相色谱法测定桦木醇含量，色谱柱为ODSC18；流动相为甲醇∶水(88∶12)，紫外检测波长为210nm，柱温 30℃；柱压6.4MPa，流速1mL/min。测定样品用0.45μm微孔滤膜过滤，待高效液相基线平稳后，用微量注射器吸取10μl进样(排除注射器中小气泡)，每一样品连续进样三次取平均值，得出峰面积，计算出含量[9,10]。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对桦木醇收率的影响

对不同提取溶剂筛选，结果表明见表1，用甲醇和乙醇作为提取溶剂，收率相同且高于其他溶剂，乙醇对人体健康危害低，所以选用乙醇作为提取溶剂较为理想。以乙醇为提取溶剂获得桦木醇粗提取物，样品的纯度用HPLC方法测定，结果如表2和图1所示。粗提取的桦木醇纯度在50%～70%之间。虽然热回流法提取收率较高，但杂质较多，对检测有一定干扰，故采用本方法之前，应先用碱性纯水加热煮沸10～30min，然后过滤，再用乙醇溶液正常热回流提取桦木醇，该方法使产品的收率与纯度均有所提高。图中箭头指桦木醇峰。

表1 不同提取溶剂对桦木醇粗提物收率的影响Table 1 Effect of different extraction solvents on Betulin yield of crude extracts

图1 粗提桦木醇的高效液相色谱图Fig.1 HPLC of crude extracts betulin

表2 乙醇回流溶液提取桦木醇的纯度Table2 Content of betulin by Ethanol extract

2.2 不同溶剂体系对桦木醇重结晶效果的影响

提取的桦木醇粗品用不同的溶剂体系进行重结晶处理，结果发现不同溶剂体系对结晶效果有显著影响，结果见表 3，从表 3数据可见，氯仿∶乙醇(1∶20)溶剂体系得到的重结晶桦木醇的纯度与结晶收率最高，是理想的重结晶溶剂体系。利用该溶剂体系，溶解粗提取的桦木醇，完全溶解后，滤除杂质，溶液在4℃重结晶，滤出结晶，减压干燥，得到结晶品。重结晶桦木醇，经HPLC测定结果如图2所示。箭头指出重结晶桦木醇峰。

图2 重结晶桦木醇HPLC图谱Fig.2 Chromatogram of recrystal betulin

表3 不同溶剂体系对结晶效果的影响Table 3 Effects of different solvents on the crystallization

2.3 桦木醇含量测定

高效液相色谱法测定白桦树皮中桦木醇含量，结果如图1,2,3所示。本方法的线性范围为15.0～300.0ug/mL，平均回收率为93.93%，提取收率为85%～90%，粗品纯度为60%～70%，重结晶纯度大于95%。高效液相色谱法测定白桦树皮中桦木醇和木桦酸含量的方法，保留时间合适，峰形好，适合定量分析。箭头指出重结晶桦木醇峰。

图3 桦木醇对照品HPLC色谱图Fig.3 Chromatogram of control betulin

3 结论

通过对桦木醇不同提取试剂的筛选以及桦木醇重结晶不同溶剂体系的优化，结果显示：以干燥的桦树皮为材料，乙醇作为提取溶剂，获得桦木醇粗提取物收率最高23%；桦木醇粗体物经氯仿∶乙醇（1∶20）重结晶后，桦木醇的纯度达到95.07%，结晶收率34.05%。

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