高效液相色谱法测定酸奶和液体奶中对羟基苯甲酸酯类的研究

文 / 梁 艳 吕海燕 刘丽君 李翠枝 王艳萍 任新志 邵振国

（内蒙古伊利集团实业股份有限公司）

对羟基苯甲酸酯类，又称尼泊金酯，因其低毒、非挥发性、良好的杀菌能力和稳定性，而被用作食品防腐剂。Routledge等[1]首次发现对羟基苯甲酸酯具有雌激素活性，对消费者的身心健康严重不利。卫生部规定了食品中对羟基苯甲酸酯类的添加限量[2]和酱油、醋、水果汁及果酱中对羟基苯甲酸酯类的测定方法[3]，也有一些地方标准规定了食品中对羟基苯甲酸酯类的测定方法，即高效液相色谱法[4]，但乳制品中对羟基苯甲酸酯类尚无国家卫生检验的标准测定方法。

鉴于此，本实验建立了简便、快速的酸奶和液体奶前处理方法，以及分析对羟基苯甲酸乙酯（EP）和对羟基苯甲酸丙酯（PP）的液相色谱法。该方法分离效果好，抗干扰能力强，且定量较准确，是检测这两种防腐剂的一种较为理想的方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

配有紫外检测器的高效液相色谱仪；超声波；甲醇、无水乙醇，为色谱纯；冰乙酸为优级纯；对羟基苯甲酸酯类标准品：对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯，纯度≥99%。

图1 对羟基苯甲酸酯类标准品的高效液相色谱图（标准品的浓度为10.0 μg/mL）

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：甲醇-水-乙酸（体积比为60∶40∶5）；检测波长：256 nm。

1.3 实验方法

1.3.1 标准工作溶液的配制

将对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯用无水乙醇配成1.0 mg/mL的混标贮备液，按实际检测要求，用无水乙醇稀释到相应浓度的混合标准工作溶液，浓度系列为1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。1.3.2 样品前处理

称取约10 g（精确至0.1 mg）样品于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超声提取30 min，冷至室温后用水定容。冷冻1 h后过滤，取滤液过0.2 μm的滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的确定

对羟基苯甲酸酯类难溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。本实验分别选用乙醇、甲醇[5]作为提取溶剂进行回收率实验。结果表明，用甲醇提取的回收率要远高于用乙醇提取的回收率。因此，确定甲醇为对羟基苯甲酸酯类的提取溶剂。

2.2 柱子的选择

本实验分别选用150 mm和250 mm的柱子对对羟基苯甲酸酯类的混标进行分离，结果表明，150 mm的柱子和250 mm的柱子均可以将对羟基苯甲酸酯类的混标分开，但是在用150 mm的柱子进行分离时，两种对羟基苯甲酸酯类的出峰时间较早，而且相隔很近。为了便于对样品中的对羟基苯甲酸酯类进行很好地分离，本实验采用250 mm的柱子进行分离。

表1 对羟基苯甲酸酯类的线性范围、线性方程和检出限

表2 酸奶和液体奶的添加回收率实验结果

2.3 标准曲线的线性范围

对羟基苯甲酸酯类的混合标准工作液用无水乙醇稀释定容，配制对羟基苯甲酸酯类标准溶液的浓度系列分别为1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。对羟基苯甲酸酯类标准品通过高效液相色谱进行分析，检测结果如图1所示。结果表明，在甲醇-水-乙酸为流动相条件下，对羟基苯甲酸乙酯的出峰时间为5.42 min，对羟基苯甲酸丙酯的出峰时间为8.12 min，而且分离效果较好。

根据色谱图中各组分的峰面积与其质量浓度进行回归，得出回归方程和相关系数，结果如表1所示，其中Y代表峰面积，X代表进样的质量浓度（μg/mL）。由表1可知，对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯的浓度分别在1～40 μg/mL的线性范围内时，线性关系良好。

2.4 回收率测定

本实验对酸奶和液体奶中对羟基苯甲酸酯类的回收率进行了测定。在酸奶和液体奶样品中分别加入1 mg/mL、1.8 mg/mL和10 mg/mL的对羟基苯甲酸酯类混合标准品进行测定，结果如表2所示。从表2可以看出，对羟基苯甲酸乙酯的回收率在97.2%～102%之间，对羟基苯甲酸丙酯的回收率在96.9%～102%之间，这说明该方法的加标回收率很好。

2.5 实际样品的检测

本实验对酸奶和液体奶的20 批次样品进行了检测，这些样品中均不含对羟基苯甲酸酯类，故对其进行了加标检测，结果表明该方法的平行性良好，符合实验要求。

3 结论

本方法以标准样品的保留时间定性，外标法定量，进行了酸奶和液体奶中对羟基苯甲酸酯类含量的测定。采用该方法能够准确定量测定酸奶和液体奶中对羟基苯甲酸酯类的含量，而且简便、快速、灵敏，重现性较好。该方法不仅是测定酸奶和液体奶中对羟基苯甲酸酯类含量的有效方法，而且也可以为乳制品中其它防腐剂的分析测定奠定基础。

[1] Parker J，Odum J，Ashby J，et al. Some atkylh benzoate preservatives（parabens）are estrogenic. Toxicolo Applied Pharmacology，1998，153（1）：12-19.

[2] GB 2760-2007 食品添加剂使用卫生标准.[3] GB/T 5009.31-2003 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定.

[4] DB37/T 1100-2008 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定 高效液相色谱法.

[5] 陈皑，何乔桑，王萍亚，等. 固相萃取—高效液相色谱法测定水果和果酱中的6种对羟基苯甲酸酯. 色谱，2009，27（6）：804-808.