贯叶金丝桃提取物对人结肠癌 HCT8细胞增殖和凋亡的影响

王丽敏,田 寅,杨 玉,卢春凤,赵锦程,刘明远

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007)

贯叶金丝桃为藤黄科金丝桃属植物,具有清热解毒、抗病毒、抗抑郁等功效[1]。贯叶金丝桃富含黄酮类抗肿瘤成分,而目前我国对其抗肿瘤的研究应用还不多[2],本实验选用人结肠癌细胞 HCT8作为研究对象,对贯叶金丝桃提取物体外抗肿瘤作用进行初步探讨,从而为天然药用植物贯叶金丝桃的开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HCT8细胞购于中国医学科学院基础医学研究所。贯叶金丝桃提取物由本实验室制备,用含2%小牛血清 RPM I1640培养液稀释至终浓度;四甲基偶氮唑蓝(M TT)、胰蛋白酶购自美国 Sigma公司;小牛血清、青-链霉素双抗、RPM I1640培养液购自天津灏洋生物公司;Fax-3200酶标仪购自美国Awareness公司;Pas流式细胞仪购自德国 Partec公司。

1.2 方法

1.2.1 HCT8细胞的培养

人肿瘤细胞 HCT8为贴壁生长细胞,加入含10%小牛血清,100U/mL青-链霉素的 RPM I1640培养液 ,置于37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。胰蛋白酶消化、传代、繁殖细胞。

1.2.2 M TT法检测贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞的生长抑制作用

取对数生长期 HCT8细胞消化后,配成单细胞悬液,以每孔2×105个细胞接种于 96孔培养板中,预培养 24h后,换液,加入不同浓度的贯叶金丝桃提取物(6.25μg/mL,12.5 μg/mL,25 μg/mL,50 μg/mL,100μ g/mL,200 μg/mL),同时设终浓度为 10μg/mL的 5-Fu阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。加药后再分别培养24h、48h、72h,每孔加入5mg/mL的 M TT溶液10μL,继续孵育4h。小心吸弃培养液,每孔加入100 μLDM SO,振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪上于490nm波长处测定各孔光吸收值(OD值),计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(对照孔 OD值-实验孔OD值)/对照孔 OD值×100%。

1.2.3 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞凋亡率的影响

取对数生长期 HCT8细胞,按 5×105个 /孔接种于24孔平底细胞培养板,预培养 24h。设置3个药物作用浓度,分别为12.5 μg/mL,25 μg/mL,50μ g/mL,同时做阴性对照孔 (加细胞和培养液,不加药物)。加药后继续培养48h。利用 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂及流式细胞仪进行凋亡百分率检测。

1.3 统计学处理

数据以平均值±标准差表示,组间显著性差异采用t检验 ,以 P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 M TT比色实验

从表1结果可知,贯叶金丝桃提取物体外可抑制人结肠癌细胞 HCT8的增殖,在6.25～200μ g/mL的范围内具有明显的剂量和时间依赖性。随着剂量的增加,抑制作用逐渐增强,而且随着时间的延长,抑制作用变化明显。表明贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞有较强的增殖抑制作用。

表1 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞生长抑制率(%)的影响 (±s,n=6)

表1 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞生长抑制率(%)的影响 (±s,n=6)

注:与5-FU对照组比较,*P＞ 0.05。

组 别 剂量 (μ g/mL) 24h 48h 72h贯叶金丝桃提取物 6.25 10.24±0.79 12.63±0.65 21.21±1.3512.5 20.37±1.48 23.87±1.08 39.85±2.0925 25.29±1.61 36.12±2.23 49.76±3.0350 31.95±2.17 57.31±3.38 79.23±2.26100 37.02±2.65 65.06±2.47 82.62±3.01*200 48.03±2.98 76.18±3.64 83.77±4.17*5-FU 10 50.83±3.59 77.33±4.09 80.36±3.99

表2 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞凋亡率 (%)的影响 (±s,n=6)

表2 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞凋亡率 (%)的影响 (±s,n=6)

注:与对照组比较,*P＜0.05,** P＜0.01。

组 别 剂量 (μ g/mL) 24h 48h 72h对照组 - 0.85±0.03 3.96±0.84 6.75±1.01贯叶金丝桃提取物 12.5 13.21±1.37* 23.13±1.95* 37.08±1.98**25 19.33±1.15* 38.46±2.28** 48.19±2.01**50 25.42±2.25* 49.87±3.49** 59.13±3.76**

2.2 贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞凋亡率的影响

从表2结果可知,贯叶金丝桃提取物处理 HCT8细胞后,会引起细胞凋亡百分率的提高,当浓度为50 μg/mL作用72h时,凋亡百分率达到(59.13±3.76)%。

3 讨论

肿瘤借助肿瘤细胞的分裂增殖而不断地生长发展。抗肿瘤药可通过抑制肿瘤细胞增殖来阻断其侵袭发展[3]。本实验采用 M T T法检测贯叶金丝桃提取物对 HCT8细胞增殖的影响。结果表明,贯叶金丝桃提取物在一定剂量范围内表现出明显的抑制肿瘤细胞生长的作用[4]。细胞凋亡与肿瘤的进展与退化关系密切,可被药物与理化因素促发[5]。凋亡已成为抗肿瘤药物研究和开发的新靶点。本实验显示 HCT8结肠癌细胞经过贯叶金丝桃提取物处理后,在流式细胞仪上检测到细胞凋亡百分率的提高,证明了贯叶金丝桃提取物对 HCT8肿瘤细胞的生长抑制作用与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。关于其作用机制有待于进一步研究。

[1]Josey E S,Tackett R L St.John’s wort:a new alternative for depression[J].International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics,1999,37(3):111-113

[2]李艳,曹学丽,付 鹏.贯叶金丝桃活性成分及其分离纯化与检测方法的研究进展 [J].药学进展,2008,32(1):15-17

[3]Sleller H.M echanisms and genes of cellular suicide[J].Science,1995,267(10):1445-1449

[4]王丽敏,江清林,毕士有,等.金丝桃甘对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用研究 [J].黑龙江医药科学,2010,33(1):73-74

[5]Johnstone RW,Ruefli AA,Lowe SW.Apoptosis:a link between cancer genetics and chemotherapy[J].Cell,2002,108(7):153-157