近红外光谱结合第一范围标定法鉴定化学降糖原料药

蔡 蕊， 王 世 盛， 孟 昱， 孟 庆 刚， 赵 伟 杰＊

(1.大连理工大学 制药科学与技术学院，辽宁 大连 116024；2.沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)

0 引 言

在制药行业，对药品生产原料的严格质量控制是确保药品质量的重要前提.传统的质量控制方法是将原料从原料仓库中取出，送到分析中心或化验室进行定性定量分析，再反馈到原料仓库，合格后才允许发放，耗时较长，无法达到及时控制质量的目的.过程分析技术(process analytical technology，PAT)，可通过在生产过程中对产品进行及时检测而达到实时监控质量的目的，而无需等到最后环节的成品检验进行质控[1～5].美国食品药品管理局(FDA)也鼓励制药企业将过程分析技术作为现行生产质量管理规范(cGMP)，并广泛地应用到药品生产过程中[6].由于NIR光谱(near infrared spectroscopy)具有穿透力强、无需样品预处理、无损、可远距离检测(光纤)等特点，在药品质量控制、真伪鉴别方面已有广泛的应用[7、8]，已成为一种重要的在生产过程中使用的过程分析技术[9].NIR光谱的应用，使得原料鉴别、检验工作可以直接在存储车间仓库或卸货现场进行，甚至无需打开样品内包装，检测时间只需几秒钟.但目前，该技术仅被少数国外制药企业用于原料进货入场验收时的质量鉴别、原料投放前的质量分析，混合、干燥、压片、包衣等过程检测及终产品原位无损分析[10、11]，并且对降糖原料药的定性分析，尚未见报道.本文结合第一范围标定法对降糖原料药NIR定性分析的可行性进行研究，试图建立一种快速、准确、无需样品预处理的鉴定8种降糖原料药的方法，以期为制药企业对降糖原料药进货验收和投料前的品种鉴别提供新型的检测手段.

1 实验材料与方法

1.1 实验仪器与材料

MPA型傅里叶变换近红外光谱仪(德国BRUKER公司)，配有积分球漫反射采样系统、RT－PbS检测器、样品转轮、透过单元、光纤探头测样器－铟镓砷(InGaAs)检测器、OPUS 6.5操作软件.

降糖原料药盐酸二甲双胍、盐酸吡格列酮、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲、格列齐特、格列吡嗪，每个品种各10批次，均由辉瑞制药有限公司大连工厂提供.

1.2 近红外光谱采集

8种降糖原料药固态粉末的近红外光谱图采集(见图1):取盐酸二甲双胍、盐酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列美脲、格列喹酮和瑞格列奈原料粉末(无需去除聚乙烯塑料包装)，使用漫反射光纤探头压住药粉，在12 500～4 000cm－1进行光谱采集，光谱分辨率为8cm－1，样品扫描次数为16次，背景扫描次数为16次，温度23～25℃，温度变化每小时不超过1℃，一天不超过2℃.

8种降糖原料药标准品溶液的近红外光谱图采集:配制盐酸二甲双胍、盐酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列美脲、格列喹酮、格列本脲和瑞格列奈的最大浓度溶液(盐酸二甲双胍浓度为20 mg／mL；盐酸吡格列酮、格列齐特和格列本脲浓度为10mg／mL；格列喹酮和瑞格列奈浓度为5 mg／mL；格列吡嗪和格列美脲浓度为2mg／mL)，装入石英液体样品池中，采用透射方式在12 500～4 000cm－1进行光谱采集，除光谱分辨率为16 cm－1外，其他参数同上.

图1 固态降糖原料药的近红外光谱图Fig.1 NIR spectra of solid oral hypoglycemic APIs

1.3 光谱预处理方法

扫描共得到96张光谱图，其中64张光谱图作为训练样品集进行模型的建立.采集8种降糖原料药标准品固态粉末的近红外光谱图时，由于样品颗粒大小、均匀性、仪器状态等因素的影响，光谱基线会产生偏差或漂移，为消除这些不良影响，原始光谱图需要经过预处理.常用的预处理方法有消除常数偏移量、减去一条直线、矢量归一化、最小－最大归一化、多元散射校正、内部标准、一阶导数、二阶导数、一阶导数＋减去一条直线、一阶导数＋矢量归一化、一阶导数＋MSC，共11种.而后以得到最大的选择性S(至少大于2，越大越好)为目标，选择最佳波数范围、算法进行建模.

2 结果与讨论

2.1 处理方法

定性分析的目的是判定测试谱图与库中参考谱图的差别.必须先定义测试谱图相似性的方法，以及一个阈值.这个阈值用来判定一张谱图是否与参考谱图相似或相同.

标准算法和因子法是定性分析时常用的两种基本算法，分析过程中，两种算法将测试谱图同所有参考谱图进行比较.比较结果即是匹配值，也对应为光谱图距离D.两张谱图越匹配，则距离越短.完全相同的谱图匹配值为零(例如:参考谱图对自己测试).

标准算法是用欧氏距离D来计算光谱图距离，计算公式为

通过欧氏距离来比较谱图的匹配度，a(k)和b(k)是谱图A、B的纵坐标值，即光谱强度.

因子法是先将谱图表示为因子谱的线性组合，a＝T1af1＋T2af2＋T3af3＋…，fi为因子谱，各因子谱正交，T为每一个因子谱的系数，其数值表征相应因子谱对所表征谱图的贡献.再用因子T(也称得分)来计算光谱图距离，公式为

然后计算各品种训练集中每一样品光谱图到该样品平均光谱图的距离(H)，并据此计算每一样品的阈值(DT):

其中max(H)为测定的样品光谱图中到该样品平均光谱图的最大距离；Sdev为H的标准偏差；X为系数，一般根据经验X选用0.25.使用上述公式来比较谱图的匹配度.

选第一范围标定法则光谱图距离的最小和最大值由第一频率范围决定.然后计算其他频率范围的距离，其值按相同范围标定，也就是与第一频率范围同样的最小和最大值.第一范围标定法与标准算法和因子法不同，重叠谱区没有合在一起.例如:如果设定第一频率区间为1 500～1 200 cm－1、第二区间为1 500～1 400cm－1，它们不会组合成一个频率范围，计算光谱图距离时1 500～1 400cm－1的数据点被使用两次.矢量归一化预处理方法不能与第一范围标定法一起使用；因为它是自动进行的.与标准算法和因子法相反，矢量归一化是对每个频率范围单独计算的，然后从这些值中计算出平均距离.

标准算法是用欧氏距离表示光谱图距离，而第一范围标定法使用相关因子.

计算Pearson相关因子r，即测出谱图A和B之间的相关性:

对每一个频率范围分别计算相关性.对某一频率范围全部数据点k求和:an和bn是归一化的谱图强度，由归一化步骤得到

式中:am和bm是响应频率范围的平均光谱强度；相关因子r的范围在－1(谱图相反)到＋1(谱图相同)之间.

相关因子按照下式变换成光谱图距离:

光谱图距离D值落在0(谱图相同)和2 000(谱图相反)之间.

模型的结果一方面看所有建模光谱图是否被唯一鉴定，另一方面还要看不同库之间的选择性，一般用S表示:

S为选择性，D是两个库平均光谱之间距离，T1与T2为两个库的阈值.S＜1:类交叉；S＝1:类之间有接触；S＞2:类之间可以完全分开，因此S越大，类之间差别越大，模型预测的准确性越高.根据实验效果，选取合适的算法.

在建立8种降糖原料药固态模型时，将采集到的原始光谱图进行各种不同预处理方法和分析方法的调试，初选定波谱范围12 072.3～4 000.0 cm－1，选择最优参数，确定的最优光谱预处理方法为一阶导数，分析方法为第一范围标定法.

在建立8种降糖原料药溶液的近红外光谱模型时，需将原料药溶解，由于溶剂甲醇的吸收很强，原始谱图所显示的信息，除几处有细小的差别外，用肉眼无法辨别其与甲醇的吸收谱图的区别(如图2、3所示)，必须经过光谱预处理方法对谱图进行预处理，选择较好的结果，建立定性分析模型.经过调试，选定扫描波谱范围10 235.7～4 237.2cm－1，确定最优预处理方法为一阶导数，分析方法为第一范围标定法.

图2 液态降糖原料药的近红外光谱图Fig.2 NIR spectra of liquid oral hypoglycemic APIs

图3 纯甲醇溶剂的近红外光谱图Fig.3 NIR spectra of pure methanol solvent

2.2 定性模型的建立

采用近红外漫反射光谱法对8种固态降糖原料药建立定性分析方法，在扫描谱区范围12 072.3～4 000.0cm－1，使用一阶导数，结合第一范围标定法进行建模.将8种降糖原料药配制成对应浓度的溶液，采用近红外透射光谱法对其建立定性分析方法，在扫描谱区范围10 235.7～4 237.2cm－1，使用一阶导数，结合第一范围标定法，建立其分析模型.

对固态、液态的降糖原料药进行NIR定性分析，从表1中可以看出，固态模型的S均大于149.161，远大于2，说明该模型可将固态原料完全地分离；从表2中可以看出，有6种溶液的S大于2，另外2种的S在1和2之间，这说明格列吡嗪、格列喹酮的甲醇溶液应用近红外光谱法鉴别结果并未得到完全的分离，可能是因为2种降糖原料药在甲醇中的溶解度有限，无法达到一定的浓度，甲醇溶剂在9 000～4 000cm－1都有很强的吸收，被检测组分浓度过低则受到甲醇吸收峰的干扰更为显著，无法体现特征信号，致使计算结果不如固态模型的好.因此，相比固态降糖原料药模型，液态降糖原料药的定性模型结果较差.

表1 固态降糖原料药定性模型建立结果Tab.1 The qualitative model results of solid oral hypoglycemic APIs

表2 液态降糖原料药定性模型建立结果Tab.2 The qualitative model results of liquid oral hypoglycemic APIs

2.3 模型的验证

8种固态降糖原料药定性分析模型的验证:取8种原料药样品，利用已经建立好的模型对未知样品进行近红外定性分析，当匹配值(测试光谱图与参考光谱图之间的光谱图距离)小于相应的阈值，而且所有其他物质的匹配值都大于相应的阈值时，说明被成功鉴定.以一种降糖药为例，分析结果如表3所示，未知样品1只有与盐酸二甲双胍匹配时匹配值小于阈值，因此被鉴定为盐酸二甲双胍.

表3 未知样品1的定性评价结果Tab.3 The qualitative evaluation result of unknown Sample 1

8种降糖原料药溶液的近红外分析模型的验证方法同上，未知样品均被鉴定成功，说明此定性模型可以对8种降糖原料药进行定性分析.

3 结 论

应用近红外光谱法结合第一范围标定法，建立了8种降糖原料药(盐酸二甲双胍、盐酸吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列本脲)的定性模型，使用固体光纤及液态透射方式采集谱图，分别在12 072.3～4 000.0cm－1、10 235.7～4 237.2cm－1，建 立NIR 8种降糖原料药固态及液态的定性分析模型，两个模型对未知原料药的鉴别结果准确率均为100%，固态分析模型得到的鉴别结果要好于液态模型.结果表明所建立的模型可以实现对8种降糖原料药快速准确的鉴别，比传统检测方法更加快速、简便，适用于制药企业在原料进厂、车间投料前逐桶定性鉴别，扩大了NIR在生产过程前端的应用，为降糖原料药质量控制提供简便、可靠的过程分析技术.

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