碱性蛋白酶酶解鸡蛋清抗氧化肽的分离纯化

王 瑞 雪, 孙 洋, 牟 光 庆, 姜 淑 娟, 钱 方

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034; 2.大连工业大学 信息科学与工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

根据自由基化学和自由基生物学理论,人体内的自由基在正常情况下不会对人体产生损伤,机体随着年龄的增长,自由基产生过多或清除过慢就会造成氧化应激,使体内的各种物质如脂质、糖类、蛋白质、DNA等发生氧化反应,引起变性、交联、断裂等氧化伤害,从而引发各种疾病[1-2]。抗氧化肽具有清除自由基抑制脂质氧化的功能。随着对蛋白酶解技术的深入研究,蛋白质酶解产生的抗氧化肽,具有极强的生物活性和多样性,安全性高。近几年从各种动植物组织酶解液中提取抗氧化肽已成为研究热点。2008年杨万根等[2]研究蛋清蛋白酶解物的抗氧化性,并分析了酶解物的氨基酸组成和相对分子量,但没有对酶解液做进一步的分离纯化；2009年周国仪等[3]用Sephadex G-25、G-15凝胶柱对鸡卵清蛋白多肽进行纯化,并研究其抗氧化性,但并未分析提纯物质的纯度。

本研究采用超滤、DEAE-52离子层析和Sephadex G-25凝胶层析3种不同的分离方法对碱性蛋白酶的蛋清酶解液进行分离纯化,利用邻苯三酚自氧化法测定抗氧化性,薄层层析法分析多肽纯度,弥补了前人研究的不足,旨在分离提取到活性强的多肽片段,为蛋清抗氧化肽的分离纯化及其应用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原 料

蛋清粉,大连韩伟食品有限公司；碱性蛋白酶(酶活力14.47 U/g),诺维信公司；Sephadex G-25,GE公司；Cellulose DE-52,GE公司；Millipore L-8200超滤杯,上海摩速科学器材有限公司；NaCl、正丁醇、冰醋酸、水合茚三酮,均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋清酶解液制备工艺

蛋清粉和碱性蛋白酶分别溶于磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH 8.0)中。蛋清液85 ℃,变性30 min,冷至50 ℃,加入酶液(10 000 U/g蛋白),使蛋清液终质量浓度为10 mg/mL。50 ℃反应5 h,沸水灭酶10 min,4 000 r/min离心15 min,上清液即为蛋清酶解液,用HEW(Hydrolysates from Egg White)表示[4]。

1.2.2 抗氧化性测定

用邻苯三酚自氧化法[5]测定样品超氧阴离子的清除能力,表示样品的抗氧化性。抗氧化肽的抗氧化性强弱与其浓度有关,在测定不同样品抗氧化性时要统一浓度,再比较其抗氧化性强弱。

按表1加入缓冲液和水,25 ℃恒温20 min后加入25 ℃预热过的邻苯三酚 (对照管用10 mmol/L 盐酸代替,调零),迅速摇匀,立即倾入比色杯中,在波长420 nm处每0.5 min测定1次吸光度值A0,共测4 min。计算溶液吸光度值随时间的变化率ΔA0。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定

Tab.1 Protocol of velocity determination of pyorgallol autoxidation

试剂加样量/mL对照管样品管0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.20,内含2 mmol/L EDTA)2.252.25H2O2.102.1010 mmol/L HCl0.15邻苯三酚0.15

样品测定:加入0.5 mL样品液,相应减少同体积水,测定加样后自氧化速率ΔA1。计算清除超氧阴离子能力,平行3次。

清除率=(ΔA0-ΔA1)/ΔA0×100%

1.2.3 超 滤

用3 ku超滤膜分离蛋清酶解液,在0.3 MPa下将蛋清酶解液分离成截留液HEW-1(>3 ku)和透过液HEW-2(<3 ku),测定两部分抗氧化性,浓缩备用[6]。

1.2.4 DEAE-52离子柱层析

超滤分离出强抗氧化活性的部分经DEAE-52离子柱层析(2.0 cm×20 cm),洗脱液依次为0、0.02、0.05、0.10、0.20 mol/L NaCl水溶液,进行梯度洗脱。上样质量浓度为10 mg/mL,上样体积为5 mL,洗脱体积流量为80 mL/h,部分收集器每管收集4 mL,检测收集液280 nm处的吸光度和抗氧化性,从而判断抗氧化肽分离效果,根据层析图谱将各组分合并浓缩,备用。

1.2.5 Sepadex G-25凝胶柱层析

DEAE-52离子柱分离得到的具有较强抗氧化性组分经Sephadex G-25凝胶柱(1.4 cm×45 cm) 进一步分离,洗脱液为纯水,上样质量浓度为5 mg/mL、体积为1 mL,洗脱体积流量为40 mL/h,部分收集器每管收集1 mL,检测收集液280 nm处的吸光度和抗氧化性来判断抗氧化肽分离效果,根据层析图谱将各组分合并浓缩,备用。

1.2.6 薄层层析[7]

用硅胶板作薄层层析板,正丁醇-冰醋酸-水(体积比3∶1∶1)作展开剂,其中加入0.4%茚三酮,85 ℃显色15 min。

1.2.7 数据统计与分析

由Origin 7.5软件处理数据,分析标准偏差并绘图。用SPSS 12.0软件分析样品超氧阴离子清除率,得到样品超氧阴离子的半抑制浓度,用IC50(mg/mL)表示[8]。

2 结果与讨论

2.1 超滤法分离蛋清酶解液

用3 ku超滤膜将HEW分成HEW-1和HEW-2两部分,在5 mg/mL相同质量浓度下,HEW、HEW-1和HEW-2的超氧阴离子清除率分别为12.75%、8.41%、15.94%。由此可见,HEW-2比HEW具有更强的超氧阴离子清除能力,文献[9]表明,小于3 ku多肽的抗氧化性更为理想。超滤分离出具较强抗氧化性组分HEW-2,经过真空浓缩,再经DEAE-52离子柱层析分离。

2.2 DEAE-52离子柱分离组分HEW-2

由图1可知,HEW-2经DEAE-52离子柱层析分离,不同盐浓度洗脱液梯度洗脱得到5个蛋白峰,分别为HEW-2-1纯水洗脱峰、HEW-2-20.02 mol/mL NaCl洗脱峰、HEW-2-3 0.05 mol/mL NaCl洗脱峰、HEW-2-4 0.10 mol/mL NaCl洗脱峰、HEW-2-5 0.20 mol/mL NaCl洗脱峰。

图1 DEAE-52离子柱分离HEW-2洗脱图谱

Fig.1 Ion-exchange chromatogram of HEW-2 of on DEAE-52 column

各分离组分超氧阴离子的清除率如图2所示,在0.5 mg/mL时,HEW-2-1无清除活性,HEW-2-2清除率为2.08%,HEW-2-3清除率为1.19%,HEW-2-4清除率为0.30%,HEW-2-5清除率为0.60%。因此,组分HEW-2-2超氧阴离子清除能力最强。重复上样,合并每次收集液,真空浓缩,再经Sephadex G-25凝胶柱分离。

2.3 Sephadex G-25凝胶柱层析分离组分HEW-2-2

由图3可知,HEW-2-2经Sephadex G-25凝胶柱层析分离出3个组分。各分离组分超氧阴离子的清除率如图4所示,在0.5 mg/mL相同质量浓度下,蛋白组分HEW-2-2-1 的清除率为0.59%,HEW-2-2-2的清除率为1.20%,HEW-2-2-3清除率最高(2.41%),是组分HEW-2-2-1的4.1倍。从峰面积上看,HEW-2-2-3含量也最多。可见,经Sephadex G-25凝胶柱分离能得到活性较强的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3。根据凝胶柱分离原理,先出现的蛋白峰要比后出现的蛋白峰的分子质量大,因此从本研究来看,针对小于3 ku 的多肽,肽链越短其抗氧化活性越强。

图2 DEAE-52分离各组分的超氧阴离子清除能力

Fig.2 Superoxide anion radical scavenging activities fractions separated by DEAE-52 column

图3 Sephadex G-25凝胶柱分离HEW-2-2洗脱图谱

Fig.3 Gel filtration chromatogram of HEW-2-2 on Sephadex G-25 column

图4 Sephadex G-25分离各组分的超氧阴离子清除能力

Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activities of fractions separated by Sephadex G-25 column

2.4 鸡蛋清抗氧化肽纯度鉴定

由图5可看出,未经纯化的鸡蛋清酶解液是各种肽和氨基酸的混合物,各组分迁移率不同,故经染色剂染色后连成一片(图5中的1)；经超滤分离后,从薄层层析结果(图5中的2)可以看出减少了很多条带,说明已经除去大量杂蛋白；经DEAE-52纤维素离子柱层析分离得到的强抗氧化组分HEW-2-2在薄层层析染色后呈现3个点(图5中的3),初步确定其由3个组分组成；最后经Sephadex G-25层析分离出蛋清抗氧化肽,在薄层层析中呈现单一点(图5中的4),说明蛋清抗氧化肽已基本上得到了纯化。

1,未经纯化的蛋清抗氧化肽；2,经3 ku超滤膜分离后的蛋清抗氧化肽；3,经DEAE-52纤维素纯化后的蛋清抗氧化肽；4,经Sephadex G-25纯化后的蛋清抗氧化肽

图5 蛋清抗氧化肽分离纯化薄层层析图

Fig.5 The TLC figure of isolation and purification of antioxidant from egg white

如表2所示,鸡蛋清酶解液经过逐步分离纯化,超氧阴离子IC50由33.41 mg/mL降低到5.63 mg/mL,最终纯化倍数达到5.63,分离得到薄层纯的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3,其超氧阴离子IC50为5.63 mg/mL,蛋白回收率为13.42%。

表2 鸡蛋清抗氧化肽的分离纯化

Tab.2 Isolation and purification of antioxidant peptides derived from egg white

纯化步骤超氧阴离子IC50/(mg·mL-1)纯化倍数蛋白回收率/%鸡蛋清酶解液33.411.00100.0超滤18.031.8558.40DEAE-52离子柱层析13.322.5125.04Sephadex G-25凝胶柱层析5.635.9313.42

3 结 论

(1)HEW超氧阴离子IC50为33.41 mg/mL,经3 ku超滤膜分离得到HEW-2,IC50降到18.03 mg/mL,纯化了1.85倍,蛋白回收率为58.4%,由薄层层析看出,超滤除去了大量杂蛋白。由此说明蛋清酶解液中分子质量小于3 ku的多肽具有较高的抗氧化性,这与之前的报道也相符。

(2)HEW-2经DEAE-52离子柱分离,得到5个组分,其中HEW-2-2的抗氧化性最强,超氧阴离子IC50为13.32 mg/mL,纯化倍数提高到2.51,薄层层析染色后,出现3个点,说明HEW-2-2主要由3个蛋白组成。

(3)HEW-2-2经Sephadex G-25凝胶柱分离得到3个蛋白组分,组分HEW-2-2-3超氧阴离子IC50为5.63 mg/mL,薄层层析显色其为单一点,说明基本上得到纯化,纯化倍数达到5.93,蛋白回收率为13.42%。HEW-2-2-3是Sephadex G-25 凝胶柱分离最后出现的蛋白峰,分子质量最小,由此推测较短肽链可能具有更强的抗氧化活性。

(4)此研究为蛋清抗氧化肽的分离纯化及工业生产提供理论依据,且应在多肽的抗氧化性和蛋白回收率之间找到一个平衡点,使工业生产时即降低工业生产成本,又提高产品的抗氧化效果,这一点还有待于进一步研究。

[1] MARNRTT L J. Oxyradicals and DNA damage[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(3):361-370.

[2]杨万根,张煜,王璋,等. 蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血酶活性及生化特性的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(6):202-207.

[3] 周国仪,成静,陈栋梁,等. 鸡卵清蛋白多肽的纯化及抗氧化作用的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(5):30-32.

[4] 田刚,陈代文,余冰,等. 酶解鸡蛋清小肽混合物对小鼠免疫功能的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2005, 41(5):14-17.

[5] 韩少华,朱靖博,王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造, 2009, 6(9):155-157.

[6] 徐明生. 鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究[D]. 西安:陕西师范大学, 2006.

[7] 许文彦,唐军,嵇长久,等. 植物环蛋白的薄层层析显色反应[J]. 中国科学, 2008, 53(5):533-536.

[8] YOU Li-jun, ZHAO Mou-ming, JOE R M, et al. Purification and identification of antioxidative peptides from loach (Misgurnusanguillicaudatus) protein hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Food Research International, 2010, 43(4):1167-1173.

[9] 曹平. 天然抗氧化肽研究进展[J]. 粮食与油脂, 2004(10):8-12.