固态发酵生产豆粕多肽饲料的温度分段调控研究

刘建峰 龚永华刘华梅 冯建波

(1.湖北轻工职业技术学院，湖北武汉430070；2.武汉科诺生物科技股份有限公司，湖北武汉 430074)

豆粕是目前畜牧养殖业使用量很大的一种优质蛋白源。但豆粕中含有大量的蛋白原抗营养因子，严重影响动物对豆粕蛋白的消化、吸收，而通过将豆粕蛋白水解成豆粕多肽，可大大提高动物对其吸收及利用率[1-2]，从而节约成本。多肽是经过蛋白酶水解处理后得到的由3～10个氨基酸组成的小分子肽，其分子量一般为1 000 Da。因多肽具有溶解度好、黏度低、吸收好和促进微生物发酵等特点，而成为豆粕发酵饲料研究的热点[3-4]。目前，生产豆粕多肽饲料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物发酵法。酸解法通过强酸、强碱的作用分解大分子蛋白为小分子肽，由于强酸、强碱具有腐蚀性，会造成大量的污染；酶解法利用酶定向分解的特性将大分子蛋白分解为小分子肽，但酶解法生产的多肽苦味较重，适口性差；微生物发酵法是利用微生物的生化代谢功能将蛋白降解或转化为多肽[5-6]。饲用多肽主要采用微生物发酵法进行生产，从本质上讲，微生物发酵法生产饲用多肽都是通过蛋白酶的酶解内剪切作用而产生的[7]。发酵菌种主要是米曲霉、黑曲霉、乳酸菌、芽孢杆菌等能分泌丰富蛋白酶的菌种[8]。目前采用固态发酵法生产豆粕多肽工艺的研究较多，但在生产应用中大多数工艺较粗放，豆粕蛋白的水解程度较低（一般水解度只有4%），不能达到多肽（水解度需要达到10%以上）的水解效果。

为了解决这一问题，本文寻求以现有发酵工艺（豆粕蛋白水解度为8%）的温度为突破点，以蛋白水解度为检测指标，期望通过对发酵过程中的温度进行分段调控，生产出优质的豆粕多肽饲料产品。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

豆粕由东海粮油工业(张家港)有限公司提供，普通型豆粕粗蛋白含量≥44%；麦麸皮为市购；糖蜜由南宁糖业股份有限公司提供；其它试剂均为化学分析纯。

1.1.2 主要仪器

生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、高压蒸汽不锈钢灭菌锅 (上海申安医疗器械厂)、SVS-1300型净化工作台(上海跃进医疗器械厂)。

1.1.3 菌种

米曲霉F-112，由本实验室保藏。

1.1.4 培养基

PDA培养基：马铃薯20 g、蔗糖2 g、自来水100 ml，pH值自然（约6.0），灭菌121℃、20 min。

麦麸培养基：麦麸90%、豆粕8%、葡萄糖2%，灭菌121℃、20 min。

固态发酵培养基：豆粕85%、麦麸10%、糖蜜4%、稻草颗粒1%、自来水110%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株最适生长温度的测定

取对数期生长的米曲霉菌种，接种到装有适量固态发酵培养基的罐头瓶（直径10 cm、高10 cm）中，分别在 20、23、26、29、32、35 ℃培养 48 h，然后计数米曲霉的孢子数量。

1.2.2 菌株蛋白酶酶活最适温度的测定

接种适量米曲霉到装有适量固态发酵培养基的罐头瓶中，培养65 h后终止培养，制成粗酶液，分别在 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下测定 pH 值 6.0 的蛋白酶酶活。

1.2.3 菌株最适产蛋白酶温度的测定

把试验1.2.1中一系列温度下培养的米曲霉培养65 h后终止培养，然后在最适温度下测定pH值6.0的蛋白酶的酶活。

1.2.4 发酵工艺温度分段调控的响应面法优化

在原有固态发酵工艺的基础上，并根据试验1.2.1、1.2.2和1.2.3的试验结果，应用试验设计软件Design-Expert 8.0中混料（mixture）设计中的Optimal设计，对固态发酵工艺中的温度进行分段控制试验。

1.3 检测方法

米曲霉孢子数量的测定采用GB 4789.15—2010食品安全国家标准中食品微生物学检验霉菌和酵母计数的方法；蛋白酶酶活的测定采用GB/T 23527—2009蛋白酶制剂的方法；水解度的测定采用甲醛滴定法[9]。

2 结果与分析

2.1 菌株最适生长温度的确定

将米曲霉分别在 20、23、26、29、32、35 ℃温度下培养48 h，然后计数米曲霉的孢子数量，其结果见图1。

从图1可以看出，曲线可以分为两个阶段，即第一阶段，温度从20℃到26℃，在此过程中，米曲霉的孢子数量逐渐增加，并达到最大值，即150亿个/g；第二阶段，温度从26℃到35℃，在此过程中，米曲霉的孢子数量基本呈下降趋势。从图1曲线来看，米曲霉的最适生长温度在26℃左右。

2.2 菌株蛋白酶酶活最适温度的确定

将米曲霉的纯培养物，制成粗酶液，分别在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下测定 pH 值 6.0 的蛋白酶酶活，其结果见图2。

从图2中可以看出，米曲霉蛋白酶的最适酶活温度在45℃左右。

2.3 米曲霉最适产蛋白酶温度的确定

将米曲霉分别在 20、23、26、29、32、35 ℃下培养65 h，然后在45℃下测定pH值6.0的蛋白酶的酶活，其结果见图3。

从图3可以看出，米曲霉产蛋白酶的最适温度在23℃左右，这与其生长最适温度（26℃左右）不同，说明米曲霉在较高的温度下生长速度较快，而在较低的温度下则更有利于产蛋白酶。

2.4 发酵工艺温度分段调控的响应面法优化

2.4.1 温度分段调控试验设计及结果

在原有固态发酵工艺的基础上，并根据2.1、2.2和2.3节的结果，应用试验设计软件Design-Expert 8.0中混料（mixture）设计中的Optimal设计，进行三段控温的固态发酵工艺优化，三段温度控制依次为26℃、23℃和45℃，三段时间控制见表1，试验设计及结果见表2。

表1 三段时间控制目标范围

表2 试验设计及结果

2.4.2 试验结果方差分析

对试验结果以二次方模型为依据进行方差分析(见表3),从表3可以看出,二次方模型的P值＜0.000 1,说明模型是显著的；在交互作用项中，AB、AC和BC都是显著的；在二次方模型的失拟项中P值为0.604 4，大于0.05，说明模型的失拟项不显著，不需要对试验结果进行更高次方模型的模拟，即二次方模型是合适的。

表3 试验结果方差分析

2.4.3 二次方模型的建立

由表3试验结果方差分析可知，本试验结果分析采用的二次方模型是合适的，可以建立如下的二次方模型：HD=-1.255 67A-2.462 81B-3.374 12C+0.115 44AB+0.137 39AC+0.079 280BC。

为了验证所建立模型的拟合程度，进行了模型的可信度分析(见表4)。

从表4模型的可信度分析中可以看出，校正复相关系数平方为0.854 0，说明以试验结果为依据建立的模型，计算出的数据可以覆盖85.4%的区域，即模型的拟合程度很好。

表4 模型的可信度分析

为了更形象地认识A、B和C因素（不同温度时间分段）对R1响应值（水解度）的影响，可以建立等高线图（见图4）和响应面图（见图5）。从图4和图5中可以看出，A、B和C 3个因素的重要性为C＞B＞A，如果A、B和C取值合适，则可以得到R1的最大值，且最大值在试验值设计覆盖的范围之内。

3 预测和验证

为了得到R1响应值的最大值，根据所建立的模型进行了R1最大值的预测，预测结果有22组数据，根据工艺的可操作性和操作的难易程度，我们选取了5组（见表5），并进行了试证试验。

表5 R1响应值最大值的预测

考虑到试验的实际情况和操作的可能性，对上述的5组数据进行了修正。在验证试验中，每一个处理做3个平行，试验结果见表6。

表6 R1响应值最大值预测的验证

4 结论

在豆粕发酵过程中，米曲霉经历了生长、产酶和酶解的三个阶段[10]，本文在原有发酵工艺的基础上，对固态发酵生产豆粕多肽饲料的温度分段调控进行了研究。通过对米曲霉生长温度、产酶温度和酶活温度的试验，得到了最适生长温度（26℃）、最适产酶温度（23℃）和最适酶活温度（45℃）等参数。然后进行了不同温度的时间段的确定试验，即试验设计软件Design-Expert 8.0中混料（mixture）设计中的Optimal优化设计，得到了最佳的时间段：0～33.5 h、26℃；33.5～50 h、23 ℃；50～65 h、45 ℃（见表 5）,并进行了验证试验，较优化前豆粕蛋白的水解度提高了140%，得到了较好的效果，基本达到了试验的目的。

[1]陈名洪,陈济琛,邱宏端,等.豆粕的微生物发酵降解[J].中国农学通报,2008,24(1):307-311.

[2]Song Y S,Frias J,Martinez-villaluenga C,et al.Immuno-reactivity reduction of soybean meal by fermentation effect on amino acid composition and antigenicity of commercial soy products[J].Food Chemistry,2008,108:571-581.

[3]钱森和,厉荣玉,魏明,等.二元复合菌固态发酵豆粕制备大豆肽的研究[J].大豆科学,2011,30(1):131-135.

[4]吴宝昌,宋俊梅.枯草芽孢杆菌与米曲霉混合发酵制备豆粕饲料的研究[J].山东轻工业学院学报,2010,24(2):12-15.

[5]Feng J,Liu X,Liu Y Y,et al.Effects of Aspergillus oryzae3.042 fermented soybean meal on growth performance and plasma biochemical parameters in broilers[J].Animal Feed Science and Technology,2007,134:235-242.

[6]Hirabayashi M,Matsui T,Yano H,et al.Fermentation of soybean meal with Aspergillus usamii reduces phosphorus excretion in chicks[J].Poultry Science,1998,77:552-556.

[7]齐葳,何志敏,何明霞.蛋白质酶促水解反应机理与动力学模型[J].天津大学学报,2005,38(9):768-773.

[8]刘建峰,葛向阳,梁运祥.响应面法优化豆粕固态发酵工艺的研究[J].中国生物工程杂志,2007,27(6):87-91.

[9]徐勤,葛向阳,刘建峰.甲醛法测大豆蛋白水解度的改进[J].饲料工业,2008,5(29):46-47.

[10]Hong K J,Lee C H,Kim S W.Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meal[J].Journal of Medicinal Food,2004,7:430-435.