大肠杆菌O157:H7实验感染动物排菌动态检测

孙茂华，孟祥升，夏兴霞，赵攀登，张雪寒，何孔旺，王永山

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点。人感染O157:H7后，出现急性腹泻、出血性结肠炎(HC)，并在5% ～10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡［1］。1982年该菌首先在美国发现，此后在世界各地散发或流行，1996年在日本大阪地区流行，患者逾万、死亡11人;2001年在中国江苏、安徽等地发生了多次食源性感染O157:H7事件，导致177人死亡。O157:H7已成为全球性的公共卫生和食品安全问题［2-4］。

人主要是经食源性或与带菌动物接触感染O157:H7，带菌动物的粪便是污染环境、食品以及水源的主要来源。从腹泻患者、畜禽粪便、市售肉类以及猪、鸽、牛、鸡、鸭等动物中均有分离出O157:H7的报道［5-6］。反刍动物是其主要的储存宿主，受感染动物通常不表现临床症状，但可经粪便排菌，因此是O157:H7的危险传染源［7］。鼠与人类生活关系密切，鼠类可以通过其排泄物污染人类的食品、食具以及生活环境，造成疾病的传播［8］。目前，我们对自然感染O157:H7动物的排菌情况还知之甚少，是O157:H7防控研究中的薄弱环节。

本实验以牛和小鼠为O157:H7感染动物模型，评价大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析检测试纸条［9-10］在O157:H7带菌动物监测中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 大肠杆菌O157:H7检测试纸条与山梨醇麦康凯琼脂培养基(为O157:H7的鉴别培养基，含100μg/ml卡那霉素、50μg/ml新生霉素、40 μg/ml万古霉素和2.5μg/ml亚碲酸盐)均由江苏省农业科学院兽医研究所生物兽药实验室研制［4］。具有卡那霉素、新生霉素、万古霉素和亚碲酸盐四种抗性的大肠杆菌国际代表菌株O157:H7 EDL933株由江苏省农业科学院兽医研究所提供。该菌株在山梨醇麦康凯琼脂培养基上的菌落特征为:菌落透明、光滑湿润。

1.2 实验动物与分组 荷斯坦奶牛12头，雌性，(10±2)周龄，普通级，购自南京卫岗奶牛场。随机分成四个组，每组3头，实验前检测粪便O157:H7为阴性。ICR小鼠20只，雄性，6周龄，清洁级，购自扬州大学实验动物中心。随机分成四个组，每组5只。实验前检测粪便O157:H7为阴性。实验动物许可证号:SYXK(苏)2010-0005。

1.3 菌液制备 将冻存于-80℃的 O157:H7 EDL933菌种划线于山梨醇麦康凯平板，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种于5 m l的LB培养基中，37℃培养8 h。取O157:H7 EDL933纯培养物，划线接种于LB琼脂平板上，37℃培养18～24 h，用生理盐水将菌苔洗脱下来。取少量菌苔洗脱液做10倍比连续稀释，每个稀释度取1ml菌液与10～15 ml溶化后冷却至45℃左右的LB琼脂培养基混匀，倒入培养皿(直径90 mm)中，水平放置，待琼脂凝固后，于37℃温箱中培养，计数菌落，计算菌液中的细菌含量［菌落数/ml，(CFU/ml)］。

1.4 动物感染 所有实验动物在感染前3 d饮用5 g/L链霉素溶液，检测肠道粪便菌数CFU/g少于103时，断水断食12 h，然后采用灌胃途径感染动物。灌胃12 h后恢复饮食、饮水(0.5 g/L链霉素溶液)。

奶牛实验组:三个感染组，O157:H7的灌服剂量 CFU/头分别为 108、1010、1012;一个对照组，只灌服生理盐水。

ICR小鼠实验组:三个感染组，O157:H7的灌服剂量 CFU/只分别为 106、108、1010;一个对照组，只灌服生理盐水。

感染后，观察实验动物的精神、行为、食欲、粪便等临床症状。收集粪便，检测O157:H7排出状况。连续观察至粪便中无O157:H7检出。

1.5 粪便收集与处理 动物感染O157:H7后，分别于2、4、6、12和24 h后收集粪便，之后每天收集一次。取牛粪便1 g(鼠粪便0.2 g)，悬于生理盐水中，获得10%(W/V)的样品悬液，震荡混合均匀，800 r/min离心5 min(离心半径8 cm)，收集上清，然后5000 r/min离心3 min(离心半径8 cm)，弃上清，1 ml生理盐水重悬菌体沉淀，检测菌液。

1.6 检测

1.6.1 试纸条检测 直接检测:分别取200μl上述菌液，滴加到O157:H7检测试纸条测试端，平放1～5 min，判定结果，无阳性反应者进行增菌检测。增菌检测:取上述菌液100μl，加入到3 ml改良EC肉汤培养基中(含20μg/ml新生霉素)，37℃振摇培养9 h，取200μl菌液用O157:H7试纸条检测。

1.6.2 鉴别培养基菌落计数 将检测菌液分别进行10倍比连续稀释，每个稀释度取1ml，与10～15ml溶化后冷却至45℃左右的O157:H7山梨醇麦康凯琼脂培养基混匀，倒入培养皿(直径90mm)中，水平放置，待琼脂凝固后，于37℃温箱中培养，计数菌落，计算菌液中的细菌含量(CFU/g)。

2 结果

2.1 奶牛感染组 奶牛感染O157:H7后未见明显的异常，也没有出现腹泻症状。用大肠杆菌O157:H7检测试纸条和鉴别培养基菌落计数两种方法平行检测粪便处理物。牛在感染O157:H7后第2天开始从粪便排菌，第4～6天达到峰值，排菌时间最长持续28 d。

感染牛粪便中O157:H7菌数与感染剂量呈正相关。108CFU剂量组在第4天;1010CFU剂量组在第2、4、6 天;CFU 1012剂量组在第 2、4、6、8 天的粪便处理液用O157:H7检测试纸条直接检测为阳性。细菌培养计数均超过106CFU/ml。

感染牛从粪便排出O157:H7的持续时间与感染剂量也呈正相关。108CFU剂量组牛排菌时间可持续10 d;1010CFU剂量组牛排菌时间可持续16 d;而1012CFU剂量组牛排菌时间可持续28 d。

用大肠杆菌O157:H7检测试纸条(直接检测、增菌检测)与细菌培养计数两种方法检测牛感染O157:H7后的粪便排菌量和持续时间，两种方法的检测结果一致，试纸条更简便、快捷、直观，在1～5 min内可得出检测结果。

三个实验组牛感染O157:H7后的粪便排菌动态如表1所示。

2.2 小鼠感染组 小鼠感染O157:H7后1～3 d内均表现出昏睡、厌食、被毛蓬松，但没有明显的腹泻症状，只有少数在攻毒后2～3 d内有稀便。临床症状与感染剂量有关，高剂量组比低剂量组临床症状重，低剂量组从第3天逐渐恢复体况，采食量逐渐增加，精神好转。用大肠杆菌O157:H7检测试纸条和鉴别培养基菌落计数两种方法平行检测粪便处理物。小鼠在感染O157:H7后4 h开始从粪便排菌，6 h达到峰值，排菌时间最长可持续15 d。

感染鼠粪便中O157:H7菌落数与感染剂量呈正相关。106CFU剂量组在6 h;108CFU剂量组在4、6、12 h;1010CFU 剂量组在4、6、12、24 h 的粪便处理液用O157:H7检测试纸条直接检测为阳性。细菌培养计数均超过106CFU/ml。

感染鼠从粪便排出O157:H7的持续时间与感染剂量也呈正相关。106CFU剂量组小鼠排菌时间可持续8 d;108CFU剂量组小鼠排菌时间可持续10 d;而1010CFU剂量组小鼠排菌时间可持续15 d。

用大肠杆菌O157:H7检测试纸条(直接检测、增菌检测)与细菌培养计数两种方法检测小鼠感染O157:H7后的粪便排菌量和持续时间，两种方法的检测结果一致，试纸条更简便、快捷、直观，在1～5 min内可得出检测结果。

三个实验组小鼠感染O157:H7后的粪便排菌动态如表2所示。

表1 牛感染O157:H7后的粪便排菌动态

表2 小鼠感染O157:H7后的粪便排菌动态

3 讨论

大肠杆菌O157:H7主要生存在多种家畜、家禽，尤其是牛、羊等反刍动物体内，此外，从鹅、鸡、马、鹿、海鸥、绵羊、山羊、鸽子、鸭、兔、狗、猫的粪便中也可分离出O157:H7。O157:H7会引起幼龄动物腹泻，从而污染农畜产品。食源性以及与带菌动物接触是人感染O157:H7的主要途径，世界各地暴发流行的O157:H7的感染都是因食用被O157:H7污染的食物引起的。

牛是O157:H7的主要宿主，牛的饲养量巨大，是环境污染的重要源头，来源于牛的制品在民众生活中占有重要地位。而鼠与人类生活关系密切，有人类居住的地方几乎都受到鼠害侵袭，鼠类可以通过其排泄物污染人类的食品、食具以及生活环境，从而造成疾病的传播。因此，以牛和鼠为O157:H7感染动物模型，检测O157:H7的排菌状况，实际意义更强。

本实验参考 Wadolkowski和 Fujii等［11-12］的方法在感染前通过饮水给动物饲喂链霉素，排除肠道正常菌群，在动物消化道内为O157:H7驯化了一个定居和生长的环境，使O157:H7能在肠道中成为优势菌群。采用灌胃攻毒方式，使小鼠感染具有卡那霉素、新生霉素、万古霉素和亚碲酸盐四种抗性的O157:H7，灌胃攻菌后继续给予小鼠0.5 g/L的链霉素溶液饮用。牛在感染O157:H7后2 d开始从粪便排菌，4 d达到峰值，排菌时间最长可持续28 d。小鼠在感染O157:H7后4 h开始从粪便排菌，6 h达到峰值，排菌时间最长可持续15 d。牛、鼠感染O157:H7后的排菌时间和持续时间存在差异，与这两种动物的消化道结构有关。大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析检测试纸条与O157:H7鉴别培养基细菌培养计数的检测结果一致，而试纸条更简便、快捷、直观，在1～5 min内可得出检测结果，便于O157:H7临床样品的快速检测以及在粪便、食品、环境污染物、水样等现场检测样品中的快速筛查。

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