黄连等7种中草药提取液对脚部真菌杀菌作用研究

柳一鸣, 陈鹏飞, 秦 华, 方雅莉, 吴 笛, 朱 政

(湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006)

黄连等7种中草药提取液对脚部真菌杀菌作用研究

柳一鸣, 陈鹏飞, 秦 华, 方雅莉, 吴 笛, 朱 政

(湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006)

采用加热回流—超声波提取法及35%的酒精萃取法提取黄连、黄芩、黄柏、花椒、甘菊、甘草、蒲公英等7种中草药活性成分, 用菌落计数法测定其对深、浅部真菌的杀菌作用. 结果表明, 这7种中草药对深、浅部真菌均有一定的杀灭作用, 其中以黄连、黄芩、黄柏最为明显, 抑菌率均在69.5%以上; 杀菌试验表明不同中草药对深、浅部真菌有不同程度的杀灭作用. 且对浅部杀菌作用高于深部, 并随着提取液用量的增加, 杀菌率均随之提高.

脚部染病真菌; 中草药提取液; 杀菌

从植物中寻找抗菌、杀菌活性物质是目前研究开发绿色防腐剂、杀菌剂的重要途径之一. 我国拥有丰富的中药植物资源, 而被用作抗菌、杀菌活性研究的植物大部分集中在菊科、唇形科、木兰科等10余科植物[1,2].目前, 临床上常用的中草药有黄芩、黄柏、黄连、花椒等几十种[3～6]. 但有关体外模拟中草药对脚深浅部染病真菌的杀菌作用方面研究仍不多. 因此, 在查阅大量文献的基础下, 筛选7种在临床上常用的中草药, 以脚深浅部染病真菌为供试菌, 进行体外模拟杀菌实验, 旨在开发绿色植物药物在“脚气”治疗上提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试中草药

黄连(Coptis deltoidea); 黄芩(Radix scutellaria); 黄柏(Cortex phellodendri); 花椒(Zanthoxylum bungeanu); 甘菊(Chamomile); 甘草(Glycyrrhiza uralens); 蒲公英(Taraxacum mongolicum)[7～13]. 均购买于湖南省岳阳市花板桥中药市场, 干燥粉碎, 备用.

1.2 供试菌种

浅部真菌: 红色毛癣菌(Trichophytosis rubrum, T1a); 须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes,T2a);絮状表皮癣菌( Epidermophyton floccosum, E1c); 深部真菌: 白念珠菌(Candida albicans, C1c); 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans, D2a). 均购自中科院南京皮肤病研究所医学真菌储藏库.

1.3 仪器与试剂

TF-IA型生化培养箱(江苏姜堰市分析仪器厂), YSQ-8G46-280S不锈钢手提式高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂), TD4A型台式低速离心机(长沙英泰仪器有限公司), KQ-300DA超声波清洗仪(江苏昆山市超声波仪器有限公司); 75%C2H5OH消毒液, 0.1mol·L-1NaOH溶液, 0.1mol·L-1NaCl溶液, 沙保液体培养基, 沙保琼脂培养基(加适量氯霉素)按常规制备[14].

1.4 中草药提取液的制备

(1) 加热—回流超声波提取法[15]. 将各种中药干燥、粉碎, 取10g粉末置于500ml的圆底烧瓶中, 加入二次蒸馏水100ml, 可调电热套加热回流2小时再在超声波清洗仪中80W功率30min条件下提取后, 用离心机3500rpm离心10min, 去除生药渣. 将上清液用二次蒸馏水定容, 使最终药物提取浓度分别为0.4g/ml、0.8 g/ml、1.2 g/ml、1.5 g/ml (1ml中含生药量), 密封, 置于0～4℃的冰箱备用.

(2) 35%的酒精萃取法[15]. 将中草药干燥、粉碎, 用35%的酒精50℃萃取24h, 将提取液离心后, 减压浓缩, 用35%酒精定容, 使最终药物提取浓度分别为0.4 g/ml、0.8 g/ml、1.2 g/ml、1.5 g/ml (1ml中含生药量), 密封, 置于0～4℃的冰箱备用.

1.5 菌悬液的配置

将活化后的供试菌种移接入相应试管斜面培养基培养, 浅部真菌置于28℃恒温箱中、深部真菌置37℃的恒温箱中培养48h. 分别用接种环取少许菌体于装有无菌生理盐水的试管中, 振荡均匀制成菌悬液. 调整菌悬液浓度用平板菌落法测定其菌液的菌体浓度并用稀释法将菌液稀释到菌体个数为

1.6 抑菌杀菌测定

将固体培养基加热熔化待冷却降至50℃, 实验组分别取1ml不同浓度中药提取液(0.4g/ml、0.8g/ml、1.2g/ml、1.5 g/ml)加入20ml固体培养基中混匀, 对照组取1ml无菌生理盐水加入20ml固体培养基中混匀,然后分别加入到D9cm无菌培养皿中, 放置24h. 在实验组、对照组分别涂布0.2ml菌液, 5种菌种分别进行实验. 浅部真菌置于28℃恒温箱中, 深部真菌置于37℃恒温箱中, 培养72 h, 每隔24 h观察记录培养皿中菌落数目, 计算杀菌率. 杀菌率=(对照组菌落数目-实验组菌落数目)/对照组菌体数目

2 结果与分析

2.1 加热回流—超声波提取法

在供试条件下, 中草药提取液的杀菌率如表1所示. 由表1可知, 7种不同中草药对深、浅部真菌均有一定的杀灭作用, 且对浅部真菌的杀菌率比深部真菌的高, 其中以黄连、黄芩最为明显, 杀菌率均分别在80.6%以上; 随着提取液含药浓度的增加杀菌率也增加, 在最大加入中草药提取液浓度1.5g/ml时, 黄连、黄芩、甘草、黄柏对浅部真菌的杀菌抑菌率达90.1%以上, 黄连、黄芩、黄柏对深部真菌的杀菌抑菌率达85.6%以上; 由杀菌试验结果不难推测不同中草药对深、浅部真菌有不同程度的杀灭作用; 深部真菌的适应性、抗药性比浅部真菌要强; 加入的药量越大, 杀菌作用则越强; 供试中草药的药性强度大小为: 黄连、黄芩、黄柏、花椒、甘草、甘菊、蒲公英.

表l 7种中草药提取液对5种菌的杀菌率(加热回流—超声波提取法)(%)

2.2 35%的酒精萃取法

在供试条件下, 中草药提取液的杀菌率见表2. 由表2得出结果为: 其中杀菌作用以黄连、黄芩最为明显, 但杀菌率只在69.5%以上; 在最大加入中草药提取液1.5g/ml时, 黄连、黄芩、甘草、黄柏对浅部真菌的杀菌抑菌率也只达78.1%以上, 且黄连、黄芩、黄柏对深部真菌的杀菌率也只达76.4%以上. 不难推测其与用加热回流—超声波提取法药效供试结果基本相似, 但在杀菌率上明显低于前者提取方法, 且不同的提取方法对中草药的有效成分提取效果不尽相同, 其中加热回流—超声波提取法的效果高于35%的酒精萃取法.

表2 7种中草药提取液对5种菌的杀菌率(35%的酒精萃取法)(%)

2.3 不同提取法下杀菌曲线图

图1 采用加热回流—超声波提取法(a)和35%的酒精萃取法(b)对D2a的杀菌作用

图2 采用加热回流—超声波提取法(a)和35%的酒精萃取法(b)对C1c的杀菌作用

图3 采用加热回流—超声波提取法(a)和35%的酒精萃取法(b)对T1a的杀菌作用

图4 采用加热回流—超声波提取法(a)和35%的酒精萃取法(b)对T2a的杀菌作用

以上关系图可知: 供试中草药的杀菌药性强度大小为: 黄连、黄芩、黄柏、花椒、甘草、甘菊、蒲公英,且7种中草药的杀菌作用均体现为阳性, 对浅部真菌的杀菌率比深部真菌的高; 也可得出加热回流—超声波提取法的效果高于35%的酒精萃取法.

图5 采用加热回流—超声波提取法(a)和35%的酒精萃取法(b)对E1c的杀菌作用

3 结论与讨论

(1) 采用现代高新仪器进行中草药有效成分提取(如: 加热回流—超声波提取法、微波提取法、CO2超临界提取法等), 其提取效果明显高于传统的加热熬煮法、萃取法, 同时大大减少提取时间、药品用量.

(2) 同一中草药对不同真菌的杀灭效果也存在较大差别, 这可能是由不同中草药所含有效成分不同所致; 且对浅部真菌的杀菌率比深部真菌高, 这可能是药物成分对不同真菌的作用机理不同所致, 深部真菌的适应性、抗药性要强.

(3) 不同中草药所含有效成分不同. 同种中草药由于来源不同、季节性变化、植物部位不同、提取方法不同, 其成分也有差别, 特别是有些活性成分对光和热不稳定, 这给中草药杀菌剂的开发带来一定难度,有待进一步研究.

(4) 目前, 我国对中草药杀菌剂的研究, 开发绿色防腐剂、杀菌剂尚处于起步阶段, 关于机理方面的研究仍在探索阶段. 目前研究的可能存在机理为: 中草药提取物抗真菌机制与抑制角鲨烯环氧化酶的活性, 影响麦角甾醇的生物合成有关; 中草药提取物抗真菌机制, 可能是通过抑制β-(1, 3)-D-葡聚糖合成酶,导致多聚葡糖的合成受阻, 细胞生长周期停滞, 真菌细胞壁的完整性被破坏, 真菌细胞内渗透压不稳定,最终导致真菌细胞溶解死亡[18].

(5) 在供试中草药以黄连、黄芩、黄柏最为明显, 其主要原因跟黄连、黄柏化学成分小檗碱(又称黄连素, Berberine, 自然界以季铵碱的形式存在), 黄芩化学成分汉黄芩素(Wogonin)、千层纸素-A(Oroxylin—A)的抑菌杀菌、杀虫作用有关, 其具体结构式如下所示[19-26].

[1] WAIN T.Secondary compounds of protective agents[J].Annua Revi-ew of Plant Physiology, 1997, 28: 479～501

[2] 吴新安, 花日茂, 岳永德, 等. 植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展(综述)[J]. 安徽农业大学学报, 2002. 29(3): 245

[3] 李 哲. 医用本草纲目[M]. 中医古籍出版社出版, 1993: 88～89

[4] 中国药科大学. 中药辞海[M]. 北京: 北京中国医学科技出版社出版, 1997, 8

[5] Geng JinYing. Medicinal Herbs Practical Traditional[M].Beijing: B-eijing New World,1998

[6] 中国大百科全书总编辑委员会. 中国大百科全书·中国传统医学[M]. 北京: 中国大百科全书出版社, 2001,1

[7] 宫 锌, 黄 睛, 宋毅斐, 等. 人体血清不同浓度金属离子对黄连、黄芩体外抗大肠杆菌活性的影响[J]. 山东医药, 2011, 5l(45): 33～34

[8] 张建军, 林 清, 李 伟, 等. 黄柏黄芩与五倍子配伍外用治疗急性湿疹的药效研究[J]. 北京中医药大学学报, 2011, 34(10): 690～693

[9] 刘仁俊. 浅谈甘草化学成分及药理作用[J]. 中国中医药现代远程教育第2011,10.9(19): 74

[10] 付陈梅, 阚建全, 陈宗道, 等. 花椒的成分研究及其应用[J]. 中国食品添加剂, 2003(4): 89～91

[11] 高鸿霞, 邵世和, 王国庆. 中药甘草研究进展[J]. 井冈山医专学报, 2004, 11(5): 8～11

[12] 宋春秀, 章家恩, 罗明珠, 等. 薇甘菊浸提液对福寿螺主要器官组织损伤的扫描电镜观察[J].生态环境学报, 2010,19(8): 1876～1880

[13] 袁 元, 赵红月, 罗 宇, 等. 张慧茹蒲公英内生真菌PG23产抗菌物质发酵培养基的优化[J]. 中国酿造, 2011(11): 90～93

[14] 周德庆. 微生物学实验教程[M]. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 2006

[15] 胡仁火, 蔡年春, 等. 10种中草药提取液抑菌杀菌作用研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(25): 11990～11991

[16] 谢水祥, 马廉兰, 等. 20种中草药对絮状表皮癣菌的抗菌实验[J]. 赣南医学院学报, 2002,10,22(4): 333～334

[17] 沈 萍, 陈向东. 微生物学实验[M]. 4版. 北京: 高等教育出版社, 2007

[18] 安惠霞, 李治建, 等. 地锦草提取物对红色毛癣菌酶活性的影响[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(4): 787～788

[19] 马天恒, 吴尚农, 等. 黄连素联合三联疗法治疗幽门螺杆菌感染54例[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2011, 19(3): 190～191

[20] 龚 淼. 黄柏的化学成分和药理作用研究[J]. 中国医院用药评价与分析, 2009, 9 (4): 318～320

[21] 富田真雄, 国友顺一.Studies on the alkaloids of Rutaceous plants V. alkaloids of Phellpdendron amurense Rupr. yar. sachalinense Fr. Schm.[J]. 药学杂志(日),1958,78(12):1444.

[22] 杨异卉, 甘春丽. 黄连化学成分的分离与鉴定[J]. 黑龙江医药报, 2009, 22(4): 480～481

[23] 温华珍, 肖盛元. 黄芩化学成分及炮制学研究[J]. 天然产物研究与开发, 2004,16(6): 575～580

[24] 董 毅, 正品黄芩与甘肃黄芩有效化学成分及抑菌作用的比较研究[J]. 中国中医药科技, 2010,5,17(3): 226～228

[25] 巢 蕾. 黄芩中千层纸素一A和汉黄芩素的分离鉴定与谱学研究[J]. 海峡药学, 2011, 23(11): 62～63

[26] 马春花. 黄芩中黄酮成分药理研究进展[J]. 养殖技术顾问, 2011, 10:190～191

Study on Coptis Deltoidea and Other Six Kinds of Herbal Extracts’ Antibacterial Sterilization on Foot Fungi

LIU Yi-ming, CHEN Peng-fei, QIN Hua, FANG Ya-li, WU Di, ZHU Zheng
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang, 414006, China)

Refluxed- ultrasonic extraction and the 35% alcohol extraction method were used to extract herbal active ingredients such as coptis deltoidea, radix scutellaria, cortex phellodendri, zanthoxylum bungeanu, chamomile, glycyrrhiza uralens, taraxacum mongolicum etc, and enumeration blatecount method was used to determine its deep and superficial fungal antibacterial sterilization. Results show that the seven kinds of Chinese herbal medicine’s sterilization to deep, superficial mycoses are at certain extent, of which berberine, baicalin, have the most obvious antimicrobial rate of 69.5%; bactericidal tests showed different Chinese herbal medicine varies in degrees of killing the deep, superficial fungal. And the seven kinds of Chinese herbal medicine have higher bactericidal effect to shallow than to deep fungi, and with the increase in the amount of the extract, the bactericidal rate increase as well.

foot disease fungi; herbal extract; bactericidal

R284.2; Q935

A

1672-5298(2012)02-0047-04

2012-04-09

湖南理工学院大学生研究性学习和创新性实验计划项目(XSKYLX201109)

柳一鸣(1958- ), 男, 湖南平江人, 湖南理工学院化学化工学院教授. 主要研究方向: 生物矿化