仿生法评定几种猪常用植物性饲料原料磷体外透析率

庄晓峰 陈 亮 张宏福 赵 峰 卢庆萍 萨仁娜 李东卫 何科林

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

作为一种非再生资源，磷在饲料工业中具有举足轻重的地位，是继蛋白质和能量之外的第3昂贵的饲料原料[1-4]。生产上为避免动物磷营养缺乏，往往向饲料中添加大量无机磷酸盐，既增加了饲料成本，也导致磷的过量排泄和对环境的严重污染[5-8]。因此，准确评定饲料磷的生物学效价对减少磷资源浪费、降低环境污染等都具有重要意义。体内法评定饲料磷生物学效价的结果虽然客观可靠，但耗时、耗力、耗资，且条件难以控制、重复性差[9]，很难满足实际需求。而体外法由于快速、简便、费用低等优点，越来越受到营养学家的关注。迄今，体外法评定饲料磷透析率的方法有试管法和透析管法。试管法由于密闭酶促反应环境中消化产物对酶促反应的抑制而遭病诟;透析管法则常将试管等容器中模拟胃的消化产物转入透析袋中进行小肠段模拟[10-14]，胃和小肠阶段之间涉及样品的转移过程，增加了试验误差。针对传统的体外消化法，动物营养学国家重点实验室开发出了单胃动物仿生消化系统，克服了传统体外消化法在消化过程中无法实现产物实时分离的缺陷，使用实时动态的消化产物分离技术，通过计算机自动控制体外消化过程，基本排除了由于人工操作引入的系统误差，提高了试验结果的重演性[15-16]。本试验利用SDS-Ⅰ型仿生消化系统，参考Liu等[11]测定饲料磷体外透析率的操作，在前期关于不同截留分子质量(MWCO)透析袋对仿生消化法评定饲料总磷体外透析率影响研究的基础上[17]，探讨消化残渣总磷测定法和透析液无机磷测定法评定饲料原料磷体外透析率的可行性，为确立仿生消化法评定猪饲料磷体外透析率的适宜操作规程提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用玉米、豆粕、菜籽粕、麦麸、米糠5种猪常用饲料原料，其磷含量如表1所示，用四分法取样后粉碎过40目筛，-20℃储存备用。MWCO为14 000和3 500 u的透析袋购自北京经科宏达生物技术有限公司(美国Viskase公司进口分装)。

表1 饲料原料的磷含量(干物质基础)Table1 Phosphorus content of feed ingredients(DM basis) %

1.2 试验设计

试验1参考Liu等[11]评定饲料磷体外透析率的操作，选用美国ViskasMWCO为14 000和3 500 u的透析袋进行试验，仿生消化结束后分别测定玉米、豆粕、麦麸消化残渣中总磷及透析液中无机磷含量，每个样品4个重复。

试验2参考Liu等[11]评定饲料磷体外透析率的操作，选用美国ViskasMWCO为14 000和3 500 u的透析袋，通过测定仿生消化透析液中的无机磷含量，评定玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麦麸的磷体外透析率，每个样品4个重复。

1.3 透析袋的处理

1.4 透析液的配制

在39℃下配制pH 6.44的乙酸-乙酸钠缓冲溶液作为小肠阶段透析液，每瓶透析液体积精确为1 L，并加入160×104U青霉素钾防止微生物的生长。

1.5 仿生消化系统操作过程

仿生消化时间及操作方法参考Liu等[11]评定饲料磷体外透析率的试验，胃和小肠段消化时间分别设置为75和240 min。具体操作为:准确称取1.000 0 g饲料原料(精确至0.000 2 g)于10 mL玻璃试管中，同时测定干物质含量，用20 mL模拟胃液(含1 475.0 U/mL胃蛋白酶)将饲料样品完全转移至装好透析袋的仿生消化管中。把消化管置于仿生消化系统中，开始试验。胃阶段消化结束后，用加酶器在每个消化管中分别加入2 mL NaHCO3溶液(调节pH为6.44)及2 mL猪模拟小肠液，使食糜中含69.10 U/mL胰蛋白酶(Amresco)、8.68 U/mL糜蛋白酶(Amresco)、221.43 U/mL淀粉酶(Sigma)，然后接通透析液管道，让小肠段透析液循环流过仿生消化管，每排5个消化管的透析液作为1个重复。待样品消化结束后，准确移取10 mL缓冲溶液瓶中的透析液于50 mL容量瓶中，采用钼黄比色法测定其中无机磷含量[18]，计算透析液中无机磷总量。同时用去离子水将透析袋中的消化液和残渣无损失的转移至150 mL的烧杯中，65℃条件下烘至无水痕后，测定残渣总磷含量[18]。

1.6 数据处理

数据用SAS 8.0的MEANS模块对基本统计量进行分析，按平均值±标准差表示;并对不同处理条件下测定结果进行成组法t检验或配对法t检验。其中数据计算公式如下:

消化残渣总磷测定法测得饲料总磷体外透析率(%)=100×[1-P3/(M0×DM0×P1)];

透析液无机磷测定法测得饲料磷体外透析率(%)=100×[P2/(M0×DM0×P1)]。

式中:M0为饲料样品重(g);DM0为饲料样品干物质含量(%);P1为饲料样品总磷含量(%，绝干基础);P2为透析液中无机磷含量(g);P3为消化残渣总磷含量(g)。

2 结果

2.1 不同MWCO透析袋条件下猪饲料原料总磷体外透析率及透析液中无机磷和有机磷比率

由表2和表3可知，MWCO 14 000 u透析袋条件下测得玉米、豆粕、麦麸总磷体外透析率分别为42.91%、48.41%和86.13%，有机磷比率分别为58.56%、61.74%和7.33%。MWCO 3 500 u透析袋条件下测得饲料原料总磷体外透析率分别为17.23%、28.04%和78.24%，有机磷比率分别为27.22%、50.11%和 1.46%，相比 MWCO 14 000 u透析袋条件下有机磷透过量已降低，但仍然没有将有机磷完全截留，没有达到无机磷与有机磷的有效分离。

表2 MWCO 14 000 u透析袋条件下猪饲料原料总磷体外透析率及透析液中无机磷和有机磷比率Table2 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

表3 MWCO 3 500 u透析袋条件下猪饲料原料总磷体外透析率及透析液中无机磷和有机磷比率Table3 Total phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients and inorganic and organic phosphorus ratios in dialysate using MWCO 3 500 u dialysis tubings %

2.2 不同MWCO透析袋条件下透析液无机磷测定法测得饲料原料磷体外透析率

由表4可知，不同MWCO透析袋条件下，透析液无机磷测定法测得饲料原料磷体外透析率存在显著差异(P＜0.05)。MWCO 14 000 u透析袋测得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麦麸磷的体外透析率分别为17.78%、18.52%、34.77%、14.09%、79.82%，显著高于MWCO 3 500 u透析袋测得结果(P＜0.05)，分别提高5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。饲料中的无机磷分子质量极小，分析本试验结果认为，不同MWCO透析袋条件下饲料原料有机磷的降解率存在差异。

表4 不同MWCO透析袋条件下透析液无机磷测定法测得饲料原料磷体外透析率Table4 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using different MWCO dialysis tubings %

2.3 仿生消化法测定猪饲料原料磷体外透析率的精度

由表5可知，MWCO 14 000 u透析袋条件下，透析液无机磷测定法测得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麦麸的磷体外透析率分别为(17.78±0.28)%、(18.52±0.32)%、(34.77±0.55)%、(14.09±0.45)%、(79.82±0.69)%，重复间最大绝对偏差分别为 0.60%、0.79%、1.24%、0.88%、1.42%，变异系数为 1.56%、1.74%、1.59% 、3.22% 、0.86% 。

表5 MWCO 14 000 u透析袋条件下透析液无机磷测定法测得饲料原料磷体外透析率Table5 Phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by inorganic phosphorus determination using MWCO 14 000 u dialysis tubings %

由表6可知，本试验测定饲料磷体外透析率的变异系数均控制在4%以内，低于Liu等[19]、方热军[12]的体外试验及贾刚等[20]的体内试验测定结果的变异系数。从本试验结果可知，与传统体外消化试验及体内试验相比，在SDS-Ⅰ型仿生消化系统上评定饲料磷体外透析率具有较好的试验精度。

表6 不同研究者测定饲料磷体外透析率的变异系数的比较Table6 The coefficient of variation of phosphorus in vitro dialyzability of feed ingredients measured by different researchers %

3 讨论

3.1 消化残渣总磷测定法评定猪饲料原料磷体外透析率的可行性

植物性饲料中的磷以无机磷和有机磷(主要是植酸磷)2种形式存在。以无机盐形式存在的磷在消化道溶解后可直接被动物吸收利用，而以有机化合物形式存在的磷必须经酶水解释放出无机磷后才能被动物吸收利用[21]，因此，消化残渣总磷测定法评定饲料磷体外透析率的可行性取决于是否存在透析袋可将饲料中有机磷完全截留。前期关于不同透析袋对仿生消化法评定猪饲料干物质和磷体外透析率影响的研究表明，美国ViskasMWCO 3 500 u透析袋条件下，消化残渣总磷测定法测得饲料磷体外透析率最低且最接近报道的体内结果[17]。本试验通过测定饲料消化残渣中总磷含量及透析液中无机磷含量，对MWCO 3 500 u透析袋分离无机磷与有机磷的有效性进行研究。

MWCO 3 500 u透析袋条件下测得玉米、豆粕、麦麸总磷透析率分别为17.23%、28.04%、78.24%，显著低于MWCO 14 000 u透析袋条件下测定结果，分别降低25.68%、20.37%、7.89%。透析袋MWCO降低，仿生消化透析液中无机磷和有机磷透析量均有所下降，但从无机磷和有机磷所占比例可以看出，有机磷透析量的降低对饲料总磷透析率的降低起了主要作用。MWCO 3 500 u透析袋条件下测得玉米、豆粕、麦麸透析液中有机磷比率分别为27.22%、50.11%和1.46%，相比14 000 u透析袋条件下有机磷透过量已降低，但是仍有部分有机磷通过透析袋进入到透析液中。MWCO 3 500 u透析袋条件下通过测定消化残渣总磷含量评定饲料磷体外透析率，会将透析液中的部分有机磷认定为可吸收磷，使测定结果偏高，因此，由于透析袋的限制，消化残渣总磷测定法并不适用于饲料磷体外透析率的研究。

3.2 不同MWCO透析袋对透析液无机磷测定法评定饲料原料磷体外透析率的影响

迄今，关于饲料磷透析率的体外评定，国内外动物营养学家都有诸多报道。大多数研究者选用MWCO 12 000～14 000 u的透析袋，通过测定透析液中无机磷含量评定饲料磷体外透析率，但关于透析袋孔径是否对饲料磷透析率存在影响尚未见报道。本试验选用MWCO 14 000和3 500 u的透析袋，利用仿生消化系统评定了5种猪常用饲料原料磷体外透析率。

从本试验结果可知，MWCO 14 000 u透析袋条件下测得玉米、豆粕、菜籽粕、米糠、麦麸磷的透析率均显著高于MWCO 3 500 u透析袋测定结果，分别提高 5.24%、4.53%、6.82%、1.63%、2.72%。根据植酸分子结构，其含有12个可解离的质子，这些位点可以与蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等物质上的阳离子基团结合，以植酸复合物的形式存在，而饲料中的无机磷分子质量很小。Newkirk等[22]研究报道植酸酶与植酸结合受到植物组织中其他组分不同程度的阻碍作用。Zyla等[10]报道，非淀粉多糖酶与植酸酶之间存在协同作用，也进一步证明了这个问题。分析本试验结果认为，MWCO 3 500 u透析袋条件下饲料有机磷的降解率低于MWCO 14 000 u透析袋。其原因是采用MWCO 3 500 u透析袋进行试验，蛋白质、淀粉等的酶解产物无法及时透析出去，对酶促反应的抑制作用导致蛋白质等降解率降低，从而导致植酸磷无法暴露出来与植酸酶结合，无机磷透析率降低。由于麦麸较高的内源植酸酶活性，本试验测得其磷体外透析率达到了79.82%，是否存在其他原因还需要进一步的研究。结合本试验结果，建议透析液无机磷测定法评定饲料磷体外透析率时采用MWCO为14 000 u的透析袋，这也与Zyla 等[10]、方热军[12]、左建军[13]、Liu 等[19]、张铁鹰[23]的报道一致。

3.3 透析液无机磷测定法评定猪饲料原料磷体外透析率的可行性

关于饲料磷体外透析率的研究，大部分研究者的操作步骤为:饲料样品与胃蛋白酶盐酸溶液混合于10 mL试管中，恒温水浴培养固定时间;胃阶段消化结束后，向上述试管中加入固定体积的含有胰蛋白酶的NaHCO3溶液，并转移至MWCO 12 000～14 000 u的透析袋中于固定体积的缓冲溶液中恒温透析，结果测定透析液中的无机磷含量计算饲料磷体外透析率。本试验在仿生消化系统的基础上对以前研究者的操作稍作改动，胃阶段即在透析袋中进行，消化结束后，通过加酶器在透析袋中加入调节pH的NaHCO3溶液及小肠模拟消化酶，有效消除了消化残渣转移过程的系统误差;小肠阶段采用循环缓冲溶液进行透析，有效避免了反应体系可能存在的饱和问题。

体外消化试验是通过模拟动物消化道环境条件来进行，但是消化道中的酶是一个复杂多变的多酶系统，且消化过程受到神经、激素系统的调节，体外条件下难以完全模拟[24]，所以在体外模拟消化试验上更应注重体外试验法的精确度、可重复性和可靠性。本试验测得饲料磷体外透析率的变异系数均控制在4%以内，低于Liu等[19]、方热军[12]的体外试验及贾刚等[20]的体内试验测定结果的变异系数。由此可得，在SDS-Ⅰ型仿生消化系统上，透析液无机磷测定法能够实现饲料磷体外透析率的研究。

4 结论

①MWCO 3 500 u透析袋条件下，饲料有机磷仍可通过透析袋进入到透析液中，因此消化残渣总磷测定法不适宜于饲料磷体外透析率的研究。

②采用透析液无机磷测定法评定饲料磷体外透析率，MWCO 14 000 u透析袋测得结果显著高于3 500 u透析袋，且试验精度优于传统体外方法，因此，MWCO 14 000 u透析袋条件下的透析液无机磷测定法更适宜于饲料磷体外透析率的研究。

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